喉痛灵颗粒HPLC特征图谱及多指标成分含量测定研究

刘利辉 卢向红 陆才洋

【摘 要】 目的：建立喉痛靈颗粒HPLC特征图谱并测定尿苷、鸟苷（R，S）-告依春、腺苷四个指标性成分的含量，为喉痛灵颗粒的质量控制提供参考。方法：采用Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，柱温：30 ℃；流速：0.9 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量10 μL；通过相似度评价结合聚类分析对10批喉痛灵颗粒特征图谱进行分析评价，并对其中的4个指标成分进行含量测定研究。结果：建立了喉痛灵颗粒的特征图谱，共标定了10个共有峰，10批样品的指纹图谱相似度在0.810～0.943；尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷分别在2.78～27.15 μg·mL-1、2.25～19.07 μg·mL-1、2.93～30.42 μg·mL-1、2.02～20.97 μg·mL-1内线性关系良好（r≥0.999 8），平均加样回收率为95.26%～103.79%，RSD为0.90%～1.72%。通过聚类分析，10批样品聚成二类。结论：建立的喉痛灵颗粒特征图谱及4个指标性成分含量测定方法简便、可靠、重复性好，可为综合评价喉痛灵颗粒的质量提供参考。

【关键词】 喉痛灵颗粒；特征图谱；尿苷；鸟苷；（R，S）-告依春；腺苷

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）08-0039-06

Abstract：Objective To establish a method for characteristic chromatogram of Hutongling granules and to detetmine the contents of four index components， uridine， guanosine， （R，S）-goitrin and adenosine，and provide reference its quality control.Methods Shim-pack VP-ODS （4.6mm×250mm， 5 μm） column was used，the mobile -phase was methanol（A）-water（B）with gradient elution.The flow rate was 0.9mL·min-1，the column temperature was 30 degrers， the detection wavelengths was 254 nm，and the injection volume was 10 μL. The similarity evaluation combined with cluster analysis was used to analyze and evaluate the characteristic map of 10 batches of Houtongling granules， and the contents of 4 index components were determined. Results The characteristic spectrum of Houtongling granules was established， and 10 common peaks were calibrated. The similarity of common peaks of 10 batches of samples ranged from 0.810 to 0.943.Uridine， guanosine， （R，S）-goitrin and adenosine had good linear relationship in the ranges of 2.78-27.15 μg·mL-1， 2.25-19.07 μg·mL-1， 2.93-30.42 μg·mL-1 and 2.02-20.97 μg·mL-1， respectively. The correlation coefficients were all more than 0.9998.The average recoveries varied from 95.26% to103.79%with the RSDs of 0.90%-1.72%.All the 10 batches of samples could be classified into two clusters.Conclusion The established characteristic chromatograms of Hutongling granule and the method for the determination of 4 index components are simple， reliable and reproducible， which can provide a reference for the comprehensive evaluation of the quality of Hutongling granules.

Key words：Houtongling Granules；Characteristic Chromatograms；Uridine；Guanosine；（R，S）-goitrin；Adenosine

喉痛灵颗粒是回春堂药业股份有限公司的拳头产品，由水牛角浓缩粉、板蓝根、野菊花、荆芥穗四味中药组成，具有清热解毒，消炎利咽止痛的功效，临床上主要用于咽喉炎、急性化脓性扁桃体炎、感冒发热、上呼吸道感染等［1］。水牛角浓缩粉为君药，其有效成分为蛋白质、多肽、生物碱类等，有清热解毒、凉血、定惊等功效［2-3］。板蓝根为臣药且是处方中投料量最大的药物，其主要活性成分为尿苷、鸟苷、腺苷核苷类和表告依春生物碱类，具有抗菌、抗病毒、抗内毒素、增强免疫和解热等药理作用［4］。喉痛灵颗粒现行质量标准为《部颁标准中药成方制剂（第五册WS3-B-1041-91）》，标准中仅有性状和3个理化鉴别项目，无含量测定方法。现有文献报道主要集中在以HPLC法测定喉痛灵颗粒中腺苷、蒙花苷、迷迭香酸、绿原酸等单一成分或几个成分的含量以及对板蓝根和荆芥穗的薄层鉴别方面［5-7］。喉痛灵颗粒为中药复方制剂，成分组成复杂，单一成分或几个成分的含量测定难以全面真实地控制产品质量，而中药特征图谱技术结合含量测定的方法具有整体、多元质控的特点，能够更全面反映中药复方制剂的质量［9-10］。因此本实验建立喉痛灵颗粒HPLC特征图谱及多指标成分含量测定方法，为其整体质量控制和标准提高提供参考依据。

1 儀器与试药

Waters e2659（Empower3色谱数据工作站，美国 Waters 公司），XSE205型电子分析天平（METTLER公司）， AUY120型电子天平（SHIMADZU），超声波清洗器（型号KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司，200w，40kHz）。

喉痛灵颗粒均由回春堂药业股份有限公司提供，批号分别为20210113（S1）、20210403（S2）、20210503（S3）、20210505（S4）、20210903（S5）、20210907（S6）、20210911（S7）、20211002（S8）、20211003（S9）、20220304（S10）；尿苷（批号110887-202104，99.6%）、鸟苷（批号111977-201501，93.6%）、腺苷（批号110879-201703，99.7%）、橙皮苷（批号110721-202019，95.3%）均购于中国食品药品检定研究院，（R，S）-告依春（批号B20104，98%）购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇（TEDIA，色谱纯）；屈臣氏蒸馏水。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B）梯度洗脱；柱温：30 ℃；流速：0.9 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量10μL。梯度洗脱条件：0～20 min，3%～10%A；20～30 min，10%～30% A；30～35 min，30%～35%A；35～56 min，35%～70%A；56～65 min，70%～72%A。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷、橙皮苷适量，分别置各50mL棕色容量瓶中，加入30%甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，分别制成尿苷0.1392 mg·mL-1、鸟苷 0.0978 mg·mL-1、（R，S）-告依春0.1950 mg·mL-1、腺苷0.1344 mg·mL-1、橙皮苷0.1001 mg·mL-1单个对照品储备液，于4 ℃冰箱保存，备用。再分别精密吸取尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷对照品储备液0.80 mL、0.90 mL、0.60 mL、0.60 mL置同一10 mL量瓶中，用30%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备  取喉痛灵颗粒（批号20211002）研细，混匀，精密称定1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声0.5 h（200 w，40 kHz），放置室温，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，过虑，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 由于尿苷、鸟苷、腺苷是四味药中的共有成分，（R，S）-告依春是板蓝根和水牛角浓缩粉的共有成分，因此按喉痛灵颗粒的制备工艺分别制备（R，S）-告依春阴性样品（缺板蓝根、水牛角浓缩粉），尿苷、鸟苷、腺苷阴性样品（缺板蓝根、野菊花、荆芥穗、水牛角浓缩粉），并按“2.2.2”项下供试品制备方法处理，得到相应的阴性样品溶液。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验 取喉痛灵颗粒（批号20211002）供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，分别记录图谱的保留时间和峰面积，以8号峰腺苷作为参照峰（S），计算10个共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积及相似度。结果精密度试验图谱的相似度结果均为1.0，共有峰相对保留时间的RSD均小于0.32% ，共有峰相对峰面积的RSD均小于2.71%，说明仪器精密度良好，符合特征图谱要求。

2.3.2 稳定性试验 取喉痛灵颗粒（批号20211002）供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，分别记录图谱的保留时间和峰面积，以8号峰腺苷作为参照峰（S），计算各共有峰的相对峰面积与相对保留时间及相似度。结果共有峰的相对峰面积RSD均小于2.10%，相对保留时间的RSD均小于0.38%，相似度大于0.999，说明样品在24 h内稳定。

2.3.3 重复性试验 取喉痛灵颗粒（批号20211002）供试品，按照“2.2.2”项方法平行制备6份，按“2.1”项下色谱条件进样，以8号峰腺苷作为参照峰（S），计算各色谱峰的相对峰面积与相对保留时间及相似度。样品色谱图的相似度达0.997以上，相对峰面积RSD均小于2.82%，相对保留时间的RSD均小于0.70%，表明方法重复性良好。

2.3.4 共有模式建立及相似度评价 10批喉痛灵颗粒样品，编号为S1～S10。分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样并记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）对10批样品的色谱分析，以S1样品（批号20210113）为参考图谱，时间宽度设为0.5 min，采用多点校正自动匹配模式，以中位数生产法得到对照图谱（图1），并建立10批喉痛灵颗粒的共有模式图（图2）。S1～S10样品与对照特征图谱的相似度结果分别为0.810、0.871、0.889、0.897、0.888、0.902、0.929、0.815、0.854、0.944。

2.3.5 共有峰的指认及相对峰面积的计算 通过相似度软件对10批喉痛灵颗粒的HPLC指纹图谱进行分析共标定有10个共有峰，通过对照品比对，指认出5个共有峰，分别为尿苷（4号峰）、鸟苷（6号峰）、（R，S）-告依春（7号峰）、腺苷（8号峰）、橙皮苷（10号峰），选择峰型较好，与相邻色谱峰分离完全、稳定性较好的腺苷作为参照峰，计算10个共有峰的相对峰面积，结果见表1。

2.3.6 喉痛灵颗粒指纹图谱聚类分析 聚类分析是将样本个体或指标变量按其具有的特性进行分类的统计方法。利用spss22.0软件，将10批样品共有峰峰相对面积为变量，以Euclidean距离平方为测度，Z标准化，采用组间连接法进行Q型聚类分析，结果如图3。在类间距为15时10批样品分成2类：S1、S2、S3、S10聚为一类，S4、S5、S6、S7、S8、S9聚为另一类，说明不同批次间的样品整体质量有一定的差异性。

2.6  喉痛灵颗粒中4个指标性成分含量测定

2.6.1 系统适用性试验 分别取“2.2.1”项下的混合对照品溶液、喉痛灵颗粒供试品溶液及各阴性样品溶液各10 μL，注入色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图（图4）。结果表明，在此色谱条件下，尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷的理论塔板数分别为 11 147、20 440、24 156、11 362；各所测成分分离度分别为3.2、2.1、6.2、16.6；阴性无干扰。

2.6.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下的尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷对照品儲备液适量，稀释成含尿苷2.78、5.57、11.14、16.71、20.89、27.15 μg·mL-1；鸟苷2.25、4.40、8.80、11.74、14.67、19.07 μg·mL-1；（R，S）-告依春2.93、5.85、11.70、18.72、23.40、30.42 μg·mL-1；腺苷2.02、4.03、8.06、12.90、16.13、20.97 μg·mL-1的混合标准溶液。吸收上述混合标溶液各10μL，注入HPLC测定，以进样浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程（如表2），结果表明4个成分进样浓度在线性范围内线性关系良好。

2.6.3 精密度试验 取“2.2.1”项同一混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，测得尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷峰面积的RSD分别为1.9%、1.7%、1.5%、1.5%，表明仪器的精密度良好。

2.6.4 稳定性试验 取同一份喉痛灵颗粒供试品液（批号20211002），按“2.1”项下色谱条件分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进行测定。结果显示：尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷峰面积的RSD分别为0.9%、1.6%、2.0%、0.3%，表明样品在24 h内稳定。

2.6.5 重复性试验 取同一批喉痛灵颗粒（批号20211002）供试品，按照“2.2.2”项方法平行制备6份，按“2.1”项下色谱条件进样。测得尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷平均含量分别为0.2813 mg·g-1、0.1545 mg·g-1、0.2948 mg·g-1、0.2516 mg·g-1，RSD分别为1.53%、1.17%、0.76%、1.27%，表明仪器的方法的重复性良好。

2.6.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的喉痛灵颗粒粉末（批号20211002）0.5 g，共6份，分别精密加入“2.2.1”项下尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春、腺苷储备液的体积为0.95 mL、0.90 mL、0.75 mL、0.90 mL，按上述“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件分析进样，记录色谱图。计算得到尿苷、鸟苷、（R，S）-告伊春、腺苷的平均回收率分别为95.26%、96.27%、100.70%、103.79%；RSD分别为1.72%、1.23%、0.90%、1.43%（n=6）。

2.6.7 样品含量测定 取10个批次的喉痛灵颗粒各3份，每份1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件进行测定，测得各批样品的平均含量，结果见表3。结果表明：各批次喉痛灵颗粒各相关成分含量都有一定差异，尤其是（R，S）-告依春，而告依春又是发挥抗病毒药理活性的关键成分，因此非常有必要建立可靠的质量控制方法控制有效成分的含量。

3 讨论

实验中分别比较了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.02%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水等不同的流动相系统，经过对各种色谱图的比较，最后确定甲醇-水为流动相；同时考察了不同流速、柱温、色谱柱以及不同检测波长对图谱的影响，最终确定了本文所述的色谱条件。通过优选，采用30%甲醇为提取溶剂、超声0.5 h为供试品溶液的制备方法。该制备方法既控制了杂质成分的量又保证有效成分的提取效果。

本实验中由于喉痛灵颗粒药味多、制备工艺为传统的水提醇沉的方式，化学成分多且复杂，主要为核苷、氨基酸、多糖、生物碱等一些水溶性成分，而告依春却是硫代葡萄糖酸盐的水解产物，与尿苷、鸟苷、腺苷水溶性核苷类成分化学性质差异大，因此需采用梯度洗脱的方式来优化色谱条件。特征图谱技术是一种可以综合评价复杂多组分化学成分的质量控制方法。实验中建立的特征图谱结合含量测定的方法具备定性和定量双重作用，能更好地把控喉痛灵颗粒的整体质量。本试验研究发现，喉痛灵颗粒虽为同一生产厂家，但各批次间的图谱和各指标性成分的含量都有一定的差别，一方面可能跟每个批次的制剂不是来自同一批次的药材有关，另一方面可能是在工艺制备过程中造成了有效成分损失，因此为提高喉痛灵颗粒的整体质量，需严控中药饮片质量，同时还需进一步优化最佳的生产工艺参数。

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（收稿日期：2022-08-18 编辑：刘 斌）