中医药改善肝动脉栓塞综合征的用药规律分析和网络药理学研究

万子璇， 李娜， 卢冬彦， 叶小卫

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510000；2.广州中医药大学第一附属医院肿瘤科，广东 广州 510000

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）作为一种临床常见消化系统恶性肿瘤，以其高发病率及高死亡率为特点，位居我国恶性肿瘤死亡原因的第二位[1]。由于肝癌早期不容易被发现，大部分病人确诊时已到中晚期，因此对于不能进行手术切除的肝癌中晚期患者来说，其首选治疗手段为血管造影下经肝动脉栓塞术（Transcatheter arterial chemoembolization，TACE）。然而，93.4%的TACE术后患者会出现不同程度的肝动脉栓塞术后综合征（post-hepatic artery embolization syndrome，PES）[2]，如恶心呕吐、肝区疼痛、低热等[3]，这些不良反应不仅会显著恶化患者的生活质量，甚至会导致一部分患者对后续化疗产生抗拒。目前，PES的发病机制尚不完全清楚，大多数学者认为是由组织缺血和化疗栓塞引起的炎症反应共同引起的[4]。有学者认为，TACE 是以牺牲肝功能来换取肿瘤的杀灭[5]，所以如何减轻介入治疗后所导致的不良反应，将成为临床研究的关键。西医对PES 尚无系统诊疗指南，而中医对于治疗TACE 术后PES 有独特优势，能通过辨证论治发挥增效减毒的作用。故本研究通过数据挖掘分析中医药辨证治疗PES的用药规律，以网络药理学初步探讨其可能的机制，为临床中医治疗PES 提供参考，以期提高TACE治疗效果。

1 资料与方法

1.1 数据来源

以“中医”“中药”“TACE 术后”“肝动脉栓塞术后”“化疗栓塞综合征”为主题词，以中国知网为例，设定检索式为（主题=“中医”OR 主题=“中药”）AND（主题=“TACE 术后”OR 主题=“肝动脉栓塞术后”OR 主题=“化疗栓塞综合征”），检索1980年1月至2022年4月期间中国知网、万方数据、维普中文期刊、生物医学四大数据库相关文献。

1.2 纳入标准

①采用中医或中药治疗原发性肝癌肝动脉栓塞化疗术后综合征，且报道为治疗有效（P＜0.05）的临床研究文献；②主要选用临床随机对照研究、临床观察。

1.3 排除标准

①疾病诊断为肝内胆管癌相关文献；②重复发表的文献；③内服药物组成和剂量不明的文献；④采用针灸相关治疗的文献。

1.4 数据处理

通过纳入、排除标准筛选，得到符合标准的文献105 篇，包含中药复方105 个。根据2020 版《中华人民共和国药典》，规范化处理纳入复方的中药名称：①统一化药物别名或俗称；②将除炒炭外的炮制方法、产地名称省略；③合并统一中药的名称。如将北芪规范为黄芪，云苓规范为茯苓，法半夏、法夏统称为半夏等。

1.5 数据录入

将规范后的105条中药复方组成数据，并进行查对，随后将数据输入到中医传承计算平台V3.0软件，为了防止出现重复、错输及遗漏等情况，采取双人录入的方式。

1.6 数据分析

利用中医传承计算机平台V3.0 软件对中药复方数据进行挖掘处理，对中药方剂中的药物频次、四气、五味、归经、功效进行描述统计。通过关联规则进行聚类分析，探索处方规律并挖掘出核心药物组合。

1.7 网络药理学

1.7.1 核心药物活性成分及靶点预测

使用数据挖掘得到的频次前五位的药物，通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），检索甘草、白术、茯苓、柴胡、党参的药物活性成分，设置口服利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30，类药性（Drug-likeliss，DL）≥0.18，并通过Uniprot数据库检索药物筛选后活性成分的蛋白靶点。

1.7.2 疾病-药物-成分-靶点网络图

通过Genecards 疾病数据库检索“Post embolization syndrome” 获取疾病靶点， 使用Venny2.1.0（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）获得药物与疾病交集靶点，导入Cytoscape3.8.2 与药物成分建立疾病-药物-成分-靶点网络图，然后将交集靶点导入STRING 数据库，得到蛋白互作网络（Protein-protein interactions，PPI）数据，最后输入Cytoscape3.8.2，生成PPI最终的可视化网络图。

1.7.3 GO及KEGG富集分析

将药物-疾病共同靶点利用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）进行基因本体（Gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的富集分析。并使用“微生信”平台，绘制出可视化的分析图。

1.8 分子对接

将PPI 网络图和数据导入Cytoscape，通过Degree、Betweenness、Closeness标准进行分析，获取核心靶点，将疾病-药物-成分-靶点网络图中Degree 值排名前4 位的有效成分，与核心靶点导入AutoDock进行分子对接，通过PyMol对结果实现可视化显示。

2 结果

2.1 中药使用情况

纳入中药复方105 首，共涉及181 味中药。其中使用频数≥30 次的高频药物共8 味，分别为甘草（75 次）、白术（60 次）、茯苓（59 次）、柴胡（55 次）、党参（44 次）、白芍（43 次）、黄芪（38 次）、半夏（33次）。

2.2 四气五味和归经分布情况

同一药物的不同性味归经均进行统计。药物四气以寒、热、温、凉划分，寒性药物频次最高，温性及平性药物次之。寒性药占比为37.74%，温性药占比为32.19%，平性药占比为25.25%，凉性药占比3.79%，热性药占比1.02%。

药物五味以酸、苦、甘、辛、咸划分，以苦味药居多，甘味药次之。苦味药占比35.33%，甘药占比34.53%，辛药占比22.36%，酸药占比5.81%，咸药占比1.98%。

分析药物归经，可见药以脾经、肺经、肝经作为主要归经为主，分别占比23.1%、19.34%、14.38%。

2.3 中药功效

对药物功效进行统计，其中补虚类中药为频次最高，占比35.06%。

2.4 组合频次及关联规则

使用“组方规律”模块，采用规则分析，并设置支持度个数为20（支持度=支持度个数/总处方数量*100%），置信度为0.7，得到组合41 个，可见核心药物组合41 个，频次最高为“甘草、柴胡”疏肝健脾组合，其次为“甘草、白术”健脾补气组合，频次≥25 的前14 个药物组合详见表1。运用关联规则对以上常用药物组合进行分析，即药物A与药物B组合使用的次数越多，则关联度越大，出现概率居前10位的结果见表2。

表1 核心药物组合Table 1 Combination of core drugs

表2 关联规则Table 2 Association rule analysis

2.5 聚类分析

使用聚类分析，设置聚类个数为3，将纳入的105 个中药复方分为3 组。核心组合①：甘草，茯苓，当归，白术，柴胡。核心组合②：甘草，柴胡，半夏，赤芍，白芍。核心组合③：甘草，茯苓，白术，党参，柴胡。

2.6 网络药理学

2.6.1 绘制疾病-药物-成分-靶点网络图

于TCMSP 数据库检索并筛选核心组合②主要成分，共获得135种活性成分，通过Genecards数据库检索“Post embolization syndrome”获取1315 个疾病靶点，将成分靶点与疾病靶点取交集，获取111个共同靶点，并将之导入Cytoscape3.8.2，绘制疾病-药物-成分-靶点网络图，见图1，将PPI 数据导入Cytoscape，绘制PPI 网络图，见图2，导出相关数据，筛选出Degree、Betweenness 值均大于2 倍平均值、Closeness 值大于平均值的靶点，获得AKT1、IL6、TNF、IL1B 4个核心靶点，见表3。

图2 蛋白互作网络图Figure 2 Protein-protein interactions network

表3 核心靶点信息Table 3 information of core targets molecular

2.6.2 GO及KEGG分析

通过DAVID 数据库对GO 和KEGG 进行富集分析，GO 富集显示靶点主要集中在膜筏、细胞外空间和细胞表面，主要参与基因表达正调节、对雌二醇的反应、对缺氧的反应等生物学过程，主要参与酶结合、蛋白质结合、细胞因子活性等分子功能。根据P 值大小对GO 富集前10 条进行可视化展示，见图3。KEGG 富集通路主要涉及IL-17、TNF、HIF-1 信号通路等。选择P值最小的前20 条，进行可视化展示，见图4。

图3 GO分析气泡图Figure 3 GO functional enrichment analysis bubble diagram

图4 KEGG富集气泡图Figure 4 KEGG pathway enrichment analysis column diagram

2.7 分子对接

从疾病-药物-成分-靶点网络中筛选出度值前4 的药物成分，分别为槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、黄芩素。将以上药物小分子分别与核心靶点AKT1、IL6、TNF、IL1B 通过Autodock1.5.6 进行分子对接，其结合能均能小于-6.0 kcal·mol-1，关键活性成分靶点结合活性良好，具体结合能见表4。选取结合能绝对值最大并能形成氢键者β-谷甾醇与TNF 通过Pymol 软件绘图进行可视化展示，见图5。

图5 分子对接可视化展示Figure 5 Core compounds and core targets molecular docking visualization

表4 分子对接验证结果Table 4 Molecular docking verification results

3 讨论

原发性肝癌在中医中属于“黄疸”“肝积”“积聚”等范畴，而其多由于肝气郁结、饮食损伤、感受邪毒等所致正气亏虚、脏腑失调，治法宜护益脾气、滋养肝阴、资肾水以息肝火[6]。有学者[7]认为TACE 术后PES 证型可分为“邪实”和“正虚”两端，邪实主要包括气滞、湿热、湿浊、血瘀等，正虚主要为脾胃虚弱和肝肾阴虚，缘因TACE 的主要作用机制为通过导管插入等手段，于肿瘤的重要血管中注入大量化疗药物以及栓塞剂，从而实现对癌细胞的直接化疗以及切断癌细胞血液供应的功能[8]，在中医范畴中属于祛邪法，中医药的辨证治疗可作为祛邪法的补充以改善肝功能及全身状况[9]。临床研究证明，中药可通过疏肝健脾、理气化痰、利胆和胃、解毒化瘀、益气和血等治法改善TACE 术后的不适症状，以提高患者生活质量[10-13]。如参桃软肝丸结合羟基喜树碱栓塞化疗能够减轻TACE 术后肝功能损害[14]，以达到“保肝抑瘤”的目的。

数据挖掘所得中药主要以补虚药为主，可见TACE 术后PES 多为虚证。其中甘草、白术、党参、黄芪俱为甘润之品，可补益肺脾之气；柴胡归肝胆经，可疏肝解郁，又可退其内热，助其升发阳气；白芍酸味之药，养血调经，敛阴柔肝，能止肝区疼痛；半夏辛温，可燥湿化痰又降逆止呕；茯苓甘淡，《药品化义》言其甘淡则能补能渗，既补脾阴又益肺气[15]。 从药物归经来看，归于脾、肺、肝经的中药最多。由于先后天的各种因素导致脾肾亏虚，不能运化，则气滞、血瘀、水停，积聚之病生，故运用健脾益气药物，脾能健运，气机通畅，病邪乃解。肝主宣发，肺主肃降，一升一降，气机乃畅，肝病多有气滞，常常影响到肺，两者互为因果，故运用入肺经药物，佐金平木，使肝肺相和。

其中第二类核心组合为甘草、柴胡、半夏、赤芍、白芍，其中柴胡、半夏、甘草有小柴胡汤之义，出自《伤寒杂病论》，主治伤寒少阳证，方中柴胡入肝胆经，为君药，疏泄气机，驱散少阳半表之邪。半夏性辛温，降逆止呕，“治吐食反胃，霍乱转筋”[16]。又赤芍苦寒，既凉血散瘀又能止痛，TACE 术后多肝区疼痛，缪希雍言赤芍“入肝家血分，主邪气腹痛”[17]，认为赤芍能攻坚破积、破除瘀血。加之组合中白芍柔肝养阴；两芍相加，能破除恶血，促新血生。潘攀等[18]通过临床研究证明小柴胡汤能有效地预防及治疗PES。郝颖等[19]通过临床观察，证实小柴胡汤联合TACE 术能改善原发性肝癌的症状，显著降低甲胎蛋白水平，提高患者健康状况。邹增城等[20]发现，小柴胡汤联合茵陈蒿汤可以改善肝功能，缓解PES 的肝区疼痛，其机制可能与其调节信号通路上下游分子的表达与氧化应激有关[21]。

目前对于PES，其发生机制并不完全明确，推测其可能与肿瘤坏死与正常肝细胞损伤有关[22]。高浓度的化疗药物在作用于局部病灶会使肝组织急性缺血缺氧，肝功能损伤，血管痉挛导致肝区疼痛，术后肿瘤坏死产生炎性物质，如肿瘤坏死因子、前列腺素，白介素，生长因子，干扰素等[23]，作为内源性发热源导致发热，其使用的化疗药物如铂类药物可能通过刺激胃肠道而引起患者恶心不适，甚至出现呕吐症状，或通过刺激膈神经导致膈肌痉挛导致呃逆不止[24]。经药理学网络筛选，发现其核心组成成分为槲皮素，山奈酚，β-谷甾醇，黄芩素。槲皮素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种功能，能通过阻断NF-κ B 信号途径，减少炎症因子的释放，增强机体的抗氧化应激能力[25]。有研究表明，山奈酚可通过抑制机体转氨酶的升高，减轻氧化应激反应、抑制炎症反应来减轻急性肝损伤[26]，同时山奈酚有助于下调PI3K/AKT/mTOR 通路，从而发挥对肝癌的治疗作用[27]。黄芩素作用广泛，徐雯星等[28]研究者发现，黄芩素对氧化应激的肝损伤模型具有保护作用，同时，在静脉注射长春新碱诱导的静脉炎家兔模型中，通过抑制细胞内活性氧的产生和NF-κB 通路的失活，降低炎症因子水平，减少血管内皮的损伤[29]。β-谷甾醇是一种来源于植物性食物的天然活性物质，其衍生物2-萘甲酰Sit酯（Sit-N）可抑制肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）的产生，发挥对急性肝损伤的保护作用[30]。Wong 等[31]发现使用β-谷甾醇预处理肝毒性小鼠，可以减轻其氧化应激损伤。同时，王凯等[32]通过实验证实β-谷甾醇可通过阻断细胞周期运转来抑制肝癌细胞的增殖。通过网络药理学获得的核心靶点为AKT1、IL6、TNF、IL1B等。AKT 又称作蛋白激酶B 或PKB，参与细胞增殖、转录、代谢、凋亡以及蛋白质合成等过程，同时又作为磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的下游蛋白，许多抗肿瘤药物能通过抑制PI3K/AKT 信号通路发挥显著作用[33]。药物也能通过阻断PI3K/AKT/mTOR 信号途径，抑制细胞炎症因子IL-6，TNF-α的合成和分泌[34]，从而发挥抗炎作用。IL-6可诱导多种急性炎症蛋白的表达，属于促炎因子的一员[35]，有研究显示，TACE 术后患者血清IL-6 水平显著高于没有PES 的患者[36]。肿瘤坏死因子（TNF）作为一种重要的细胞因子，常参与全身炎症过程[37]，其受体之一TNFR1 能激活NF-κB、c-Jun、MAPK 通路，从而引起各种经典促炎细胞因子的表达，有研究证明，中药可通过降低白介素-2（Interleukin- 2，IL-2）、IL6、TNF-α 等炎症因子的水平改善肝癌炎症微环境，从而减少PES 的发生[38]。KEGG 富集分析结果表示核心处方主要涉及白介素-17（Interleukin- 17，IL-17）、缺氧诱导因子-1（Hypoxia-Inducible Factor 1，HIF-1）、TNF 信号通路改善PES，IL-17 信号通路主要涉及炎症过程，有研究显示，在过氧化氢诱导的小鼠肝细胞缺氧模型中，下调IL-17 可减少肝细胞的氧化应激[39]。研究发现HIF-1在各种缺氧组织中常显著增加[40]，HIF-1 信号通路的激活，可诱导下游蛋白血管内皮生长因子和促红细胞生成素的产生，发挥对缺氧细胞的保护作用[41]，推测该核心组合可能通过抑制IL-17 通路的表达，上调HIF-1 通路，抑制炎症因子IL-6、TNF 等炎症因子的产生，同时保护缺氧的肝细胞，从而改善PES。

综上，肝癌PES 证型众多，易兼杂他证，但在临床治疗上仍有一定规律，患者多有脾虚之证，同时兼有肝郁气滞、瘀毒、痰热、阴虚等，治疗上多以补脾益气为主，兼以益阴、疏肝理气、化瘀解毒、清热化痰等，中医药改善PES 通过多通道、多靶点发挥治疗作用。本研究通过对运用中医药治疗PES 的临床研究进行数据挖掘，筛选出105个中药复方作为研究内容，在一定程度上可以反映临床治疗肝癌PES 的用药规律，分析结果对临床治疗PES 有一定的参考价值，但其疗效待进一步临床研究的验证。