针对外阴阴道念珠菌病中NLRP3炎症通路的抗炎治疗进展

黄志晟，胡云峰

（暨南大学附属第一医院皮肤科，广东广州 510630）

外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是女性阴道感染中最常见的疾病之一，其主要的临床表现是外阴瘙痒、性交痛、尿痛、排尿困难、豆腐渣样阴道分泌物等［1］。原发性VVC 发作后常伴随着复发，并且病原体会逐渐耐受抗真菌药物，最终使患者进入疾病的慢性复发性状态中，即复发性外阴阴道念珠菌病（recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC）［2-3］。VVC 及RVVC的病原体——白念珠菌（candida albicans，C.albicans）属于定植于人类肠道和粘膜表面的良性菌，但在机体免疫功能受损时可以引起侵袭性念珠菌感染［4］。VVC的出现及复发，都与白念珠菌诱导的焦亡密切相关。白念珠菌入侵机体后能够在阴道上皮组织中激活NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（nodlike receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的组装，启动炎症通路，最终导致焦亡，造成机体的炎性损伤。因此，寻找在此通路上存在的抗炎靶点、研究针对性的新型抗炎药物，对治疗VVC有着重大意义。

1 NLRP3炎症小体在外阴阴道念珠菌病致病机制中发挥重要作用

人体的先天免疫系统对识别和响应病原微生物的侵入发挥着极其重要的作用。在侵入机体后，白念珠菌诱导先天免疫系统中NLRP3 炎症小体的组装，进而对病原体作出响应［5］。白念珠菌体表面的β-葡聚糖激活Toll 样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）或Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4），并经髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）激活转录因子核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）上调NLRP3 和IL-1β（interleukin-1 beta）的表达。同时，病原体的入侵诱导由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing a CARD，ASC）和半胱氨酸天冬蛋白酶-1（Caspase-1）的寡聚体组装，形成NLRP3炎症小体复合体［6］。诱导Caspase-1 自剪切成活化形式，活化后的Caspase-1 将炎症细胞因子白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素-18（interleukin-18，IL-18）的前体剪切进而活化；与此同时，巨噬细胞发生程序性细胞溶解性死亡，即焦亡——在NLRP3 炎症小体及K+外流的介导下，Gasdermin D（GSDMD）发生裂解，释放成孔结构域（pore-forming domain，PFD），之后PFD 与细胞膜结合并经历构象变化形成寡聚孔，IL-1β、IL-18 等炎症因子通过寡聚孔释放至胞外引起炎症。最终，神经损伤诱导蛋白1（nerve injury-induced protein 1，NINJ1）介导细胞的破裂［7-12］。研究表明，白念珠菌细胞壁的β-葡聚糖还可通过激活巨噬细胞上的Dectin-1 受体，并经脾脏酪氨酸激酶（Syk）最终活化NLRP3 炎症小体［13］。Dectin-1 是一种II 型跨膜受体，能识别和结合白念珠菌细胞壁的β-葡聚糖，触发细胞内信号传导，招募其下游的Syk，激活经典的NF-κB 信号途径，启动焦亡反应［14］。这两条以NLRP3 炎症小体为中心的通路可以促进炎症反应，并招募巨噬细胞、激活中性粒细胞以清除阴道组织中的病原体［1，15］。

但是，IL-1β、IL-18 等大量的炎症因子会在NLRP3 炎症通路的下游得到释放，导致广泛的细胞死亡，进而加重组织的炎性损伤［16］。因此，抑制NLRP3 及其上下游的关键蛋白，阻断炎症通路，减少炎症因子的产生可能是减轻VVC 炎性损伤的一种策略。

2 NLRP3炎症通路上抗炎新靶点、新通路的发现

2.1 NINJ1可能成为新的抗炎靶点

宿主感染白念珠菌后，由NLRP3 介导引起的焦亡是导致巨噬细胞第一波死亡的主要原因［17-18］。如前文所述，焦亡的发生需要PFD 的寡聚和质膜孔道的形成，小分子的促炎因子IL-1β、IL-18通过孔道释放，而大分子的高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）等则通过细胞表面的NINJ1 所引起的质膜破裂（plasma membrane rupture，PMR）从细胞中释放［12］。NINJ1具有两个跨膜结构域和一个进化保守的细胞外两亲性螺旋，缺乏NINJ1 的细胞在GSDMD 裂解后死亡，但仍保持膨胀，无法释放大分子蛋白质［12］。所以靶向NINJ1 或其上游的GSDMD，抑制PMR 的发生，可能成为治疗炎症的方法。Newton 等人通过正向遗传筛查等机制分析表明，炎症小体激活时，调控因子RAG 复合体通过线粒体活性氧物（reactive oxygen species，ROS）的介导，控制处于GSDMD 裂解下游的雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）依赖性事件，促进GSDMD 寡聚和孔道的形成［19］。这项研究查明了GSDMD 的调控因子，为今后建立以GSDMD、NINJ1 为靶点的抗炎治疗方案提供了启发。

2.2 IL-18、IL-9对NLRP3炎症通路的调节作用

IL-1β 的持续产生、中性粒细胞的募集以及NLRP3 炎症小体的过度激活被认为是VVC 的主要致病因素［20］。Borghi 等发现IL-18 也参与了阴道粘膜中宿主和白念珠菌的反应过程。在感染的初始阶段，被IL-18、IL-22激活的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白4（NOD-like receptor family，pyrin domain-containing protein 4，NLRC4）炎症小体诱导白细胞介素1 受体拮抗剂（interleukin-1ra，IL-1ra）抑制NLRP3 炎症小体的活性以及IL-1β 的生成，从而促进炎症反应的消退。他们推测，利用吲哚-3-醛靶向芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）、激活IL-22 的产生、促进IL-18 的表达，能够成为VVC 抗炎的新通路［21］。

另一方面，受白介素-9（interleukin-9，IL-9）能够调节肠道中白念珠菌的启发，Renga 等发现IL-9 在VVC 中发挥着双重作用，即在发病初期通过上调NLRP3 炎症小体活性水平、促进黏膜肥大细胞的扩张而具有促炎活性，若中和IL-9 则能缓解炎症，恢复阴道上皮内稳态；在炎症消退阶段，IL-9能够促进IL-1ra 的产生以及肥大细胞的激活而使机体耐受白念珠菌［22］。上述发现为基于中和IL-9 的替代治疗提供方向。但是，目前为止尚未有明确的抗炎新通路应用于临床VVC的治疗中。

3 针对NLRP3炎症通路的新型抗炎药物的探究

3.1 一氧化氮负调控NLRP3 炎症小体的抗炎治疗进展

1997年，Li等［23］发现一氧化氮（nitric oxide，NO）能对纯化的人重组Caspase-1 中的半胱氨酸残基直接进行S-亚硝基化，可逆地抑制Caspase-1的蛋白水解活性，阻止其对IL-1β、IL-18的加工。另外在对肿瘤细胞的研究中，科学家发现，NF-κB的S-亚硝化与肿瘤细胞的凋亡密切相关：NO通过S-亚硝化能够影响NF-κB 中P50 与DNA 的结合，抑制与焦亡相关的基因（NEK7、NLRP3、GSDMD）的转录，从而阻断焦亡的进程［24］。

随着研究的不断深入，科学家发现NO 不仅能抑制肿瘤细胞的焦亡，还能影响因病原体入侵而在焦亡通路中表达的关键蛋白。Hernandez-Cuellar 等发现，NO 供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（S-Nitroso-Nacetylpenicillamine，SNAP）能显著抑制由干扰素β（interferon -β，IFN -β）预处理或由内毒素（lipopolysaccharide，LPS）长期刺激下引起的NLRP3炎症小体的激活。通过生物素转换技术，他们发现，NO 早期抑制NLRP3 炎症小体激活的机制是直接对NLRP3蛋白进行S-亚硝化，并且发现NLRP3的C-末端区域比N-末端区域更容易发生S-亚硝化［25］。这也许是因为NLRP3 的热蛋白结构域（pyrin domain，PYD）组分存在着一个二硫键，它是氧化还原活性的靶标，通过破坏这个二硫键，NO 阻止了NLRP3 与ASC 的组装，从而抑制炎症小体复合体的功能［26］。Mao 等也发现，诱导型NO 合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）产生的内源性NO 也能负调控NLRP3 炎症小体的激活；体内实验表明，iNOS缺陷型或以药物抑制小鼠内源性NO 的产生增加了NLRP3 炎症通路上的细胞因子的产生，使LPS 诱导的小鼠脓毒血症的死亡率上升。在使用外源性的NO 进行治疗时，他们还发现，在小鼠和人类骨髓细胞来源的巨噬细胞中，NO能抑制受LPS及尼日利亚菌素诱导激活的、经NLRP3 介导的ASC 的再分布和寡聚化，进而影响Caspase-1 的募集及下游IL-1β 的分泌［27］。VVC 中白念珠菌所触发的焦亡通路正是由NLRP3 炎症小体介导的［17］，上述研究结果表明NO 能负调控NLRP3 炎症小体，对研究NLRP3 炎症小体所参与的白念珠菌感染性疾病的抗炎治疗具有重要的启发意义。

3.2 新型药物抑制NLRP3 炎症通路关键蛋白的研究进展

近年来，科学家们在研制针对VVC 的新型抗炎药物上进取得了可观的进展。章康等［28］发现利用白头翁汤丁醇提取物（n-butanol alcohol extract of Baitouweng Decoction，BAEB）对雌激素依赖性VVC小鼠模型进行干预，可下调NLRP3 炎症小体及相关信号通路中关键蛋白的表达，进而减轻小鼠VVC 的炎性损伤。盐酸小檗碱是BAEB 中含量最多的有效成分之一［29］，体外实验表明，用一定浓度的盐酸小檗碱干预被白念珠菌刺激的巨噬细胞后，TLR4/NFκB通路上的部分关键蛋白如TLR4、NF-κB、NLRP3、Cleaved Caspase-1，及其下游表达的炎症因子IL-1β、IL-18 水平均显著降低［30］。HU 等［31］发现，含有BAEB 的血清还能抑制Dectin-1/Syk 信号通路，同样阻止了NLRP3 炎症小体的激活以及ROS 的释放。至此，相关的研究初步阐明了BAEB 通过下调NLRP3 炎症小体等关键蛋白，进而抑制TLR4/NFκB 和Dectin-1/Syk 通路的机制。不仅于此，胡凯帆等［32］还发现，经BAEB 治疗后的VVC 小鼠，其表达于阴道黏膜的PKCδ/NLRC4/IL-1Ra 轴能够恢复至患病前的正常水平，提示BAEB 具有重新激活PKCδ/NLRC4/IL-1Ra 轴，使其抑制NLRP3 炎症小体的过度激活，减少炎症因子IL-1β 的释放，缓解阴道黏膜损伤的功能。

“老药新用”的思路似乎也适用于VVC 的抗炎治疗上。Lowes 等［33］发现第二代磺脲类抗糖尿病药物（格列本脲、格列西吡特、格列喹酮和格列美脲）可非靶向性抑制NLRP3 炎症小体激活，但尚不能明确其中的具体机制，推测这类药物以某种方式改变了真菌细胞壁的结构，使病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）难以启动炎症小体的组装。在此基础上，Hill 等［34］研究发现，用NLRP3 炎症小体抑制剂MCC950 中的吲哚环取代磺脲类药物的脂环基可以增强该抑制作用。

4 展望

在细胞和分子水平上，白念珠菌诱导的焦亡通路主要由依赖于K+外流的NLRP3炎症小体介导［35］。而缺乏NLRP3 或Caspase-1 这类关键炎症小体成分的小鼠被发现比野生型小鼠对多菌种和LPS诱导的脓毒症更具抵抗力［16］。因此，探究炎症小体及其他焦亡关键蛋白与VVC 间的调控关系、作用机制，能够拓宽我们对关键蛋白在VVC 炎症通路中所扮演的角色的认识，进一步为我们在焦亡通路中发现新靶点、新药物提供方向。