UPLC法测定婴幼儿配方奶粉中黄曲霉毒素M1

杨雅雯 张美秀 蒲小春

摘 要：目的：研究婴幼儿配方奶粉中黄曲霉毒素M1的超高效液相色谱测定方法。方法：样品经甲醇-水溶液提取，上清液稀释，经免疫亲和柱净化和富集，再氮吹复溶后，用超高效液相色谱仪（荧光检测器）分析测定。结果：黄曲霉毒素M1在0.051 5～5.150 0 ng·mL-1线性良好，回归方程为Y=4.00×105X-8.74×103，相关系数为0.999 867，检出限为0.02 μg·kg-1，定量限为0.05 μg·kg-1；加标回收率在81.0%～90.3%，变异系数为0.72%～3.18%，且正确度较好。结论：该方法灵敏度高、准确性好，适用于测定婴幼儿配方奶粉中黄曲霉毒素M1的测定。

关键词：超高效液相色谱；黄曲霉毒素M1；婴幼儿配方奶粉

Determination of Aflatoxin M1 in Infant Formula Milk Powder by UPLC

YANG Yawen， ZHANG Meixiu， PU Xiaochun

（Meilu Biotech Co.， Ltd.， Jiujiang 332000， China）

Abstract： Objective： To study the determination of aflatoxin M1 in infant formula milk powder by ultra-high performance liquid chromatography. Method： The sample was extracted by methanol-water solution， diluted by supernatant， purified and enriched by immunoaffinity column， and then dissolved by nitrogen blowing， then analyzed and determined by ultra-high performance liquid chromatography （fluorescence detector）. Result： The linearity of aflatoxin M1 was good in 0.051 5～5.150 0 ng·mL-1， the regression equation was Y=4.00×105X-8.74×103， the correlation coefficient was 0.999 867， and the detection limit was 0.02 μg·kg-1， limit of quantitation was 0.05 μg·kg-1； The recovery rate of spiking was 81.0%～90.3%， CV was 0.72%～3.18%， and the accuracy was good. Conclusion： The method has high sensitivity and accuracy， and is suitable for the determination of aflatoxin M1 in infant formula milk powder.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography; aflatoxin M1; infant formula milk powder

黃曲霉毒素M1是一种有机化合物，主要用于新陈代谢和致癌性的研究。由于黄曲霉毒素具有强致癌性，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将其列为1类致癌物[1]。当哺乳动物食用黄曲霉毒素污染的食物后，代谢物会分泌到乳汁中造成污染[2-3]。黄曲霉毒素M1的检测方法主要有液质联用法[4-6]、液相色谱法[6-9]和酶联免疫法[6，10]等。其中酶联免疫法检测操作快速、方便，检测成本相对较低，应用广泛；液相色谱法和液质联用法准确度高，灵敏度好，但液质联用法所需设备昂贵，检测成本高。《食品安全国家标准 黄曲霉毒素M1的测定》（GB 5009.24—2016）中规定使用酶联免疫法检出有黄曲霉毒素M1时，需使用液相色谱法或是液质联用法进行确认。在使用液相色谱法检测黄曲霉毒素M1时发现，黄曲霉毒素M1对液相色谱仪荧光检测器的灵敏度要求较高，一般的荧光检测器灵敏度度无法满足GB 5009.24—2016中规定的特殊膳食食品中黄曲霉毒素M1检出限为0.02 μg·kg-1的要求。本研究采用超高效液相色谱仪（Ultra-High Performance Liquid Chromatography，UPLC）的快速高通量荧光检测器进行黄曲霉毒素M1的检测，并对液相色谱条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乙腈、甲醇，色谱级，Fisher；氯化钠、氯化钾，分析纯，天津永大；磷酸氢二钠，分析纯，西陇化工；磷酸二氢钾，分析纯，西亚试剂；盐酸，分析纯，科隆化学品；黄曲霉毒素M1免疫亲和柱，浙江月旭。黄曲霉毒素M1标准溶液，上海安谱。

超高效液相色谱仪（配有荧光检测器），Waters；分析天平，赛多利斯；水浴锅，江苏金怡；旋涡振荡器，海门其林贝尔；超声波清洗仪，国环高科；离心机，湖南湘仪；固相萃取仪，博纳艾杰尔；氮吹仪，奥盛仪器。

1.2 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC?BEH C18柱，100 mm×2.1 nm，1.7 μm；柱温：40 ℃；流动相：A相为水，B相为乙腈。等度洗脱条件：A，70%；B，30%。流速：0.2 mL·min-1。荧光检测波长：发射波长365 nm；激发波长：435 nm；进样量：10 μL。

1.3 标准溶液配制

将黄曲霉毒素M1标准储备液（10.3 μg·mL-1）用乙腈稀释成浓度为103 ng·mL-1的标准工作液，分别准确移取标准工作液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL至10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，配制为0.051 5 ng·mL-1、0.103 0 ng·mL-1、0.515 0 ng·mL-1、1.030 0 ng·mL-1、2.060 0 ng·mL-1和5.150 0 ng·mL-1的系列标准溶液。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取

样品提取参考《食品安全国家标准 黄曲霉毒素M1的测定》（GB 5009.24—2016）第二法高效液相色谱法12.1进行处理后，样液备用。

1.4.2 净化

免疫亲和柱取出恢复至室温。将免疫亲和柱连接于50 mL注射器下，空气压力泵与免疫亲和柱连接，免疫亲和柱内的液体放空后，将上述样液移至50 mL注射器筒中，调节压力使溶液以2～3 mL·min-1（1～2滴/s）流速缓慢通过免疫亲和柱，至溶液全部抽空。更换10 mL注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10 mL水，调节压力使水以6 mL·min-1流速清洗亲和柱；准确加入4 mL乙腈洗脱，流速为1～2 mL·min-1，收集全部洗脱液于玻璃试管中，在50 ℃下氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用初始流动相定容至1 mL，涡旋30 s溶解残留物，用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

2 结果与分析

2.1 色谱条件选择

2.1.1 检测波长选择

在相同仪器条件下噪音水平相当，峰高越高灵敏度越高。对比不同波长的响应效果，在其他条件一致的情况下，发射波长365 nm，激发波长435 nm处的峰响应比发射波长360 nm，激发波长430 nm处的峰响应更高，见图1。因此选用发射波长365 nm，激发波长435 nm。

2.1.2 流动相选择

对比水-（甲醇+乙腈）（70∶30）、水-（甲醇+乙腈）（75∶25）、水-乙腈（70∶30）和水-乙腈（75∶25）4种流动相体系，发现使用水-乙腈、水-（甲醇+乙腈）均能够有效分离黄曲霉毒素M1。由图2可以看出，使用水-乙腈作为流动相体系时，峰响应要优于水-（甲醇+乙腈）的流动相体系。水-乙腈（70∶30）的流动相体系和水-乙腈（75∶25）的流动相体系可以获得相似的保留情况，但使用水-乙腈（70∶30）作为流动相可以获得更尖锐的峰形，从而提高灵敏度。因此本文选择使用水-乙腈（70∶30）作为流动相。

2.2 方法的线性范围、检出限及定量限

采用质量浓度为0.051 5 ng·mL-1、0.103 0 ng·mL-1、0.515 0 ng·mL-1、1.030 0 ng·mL-1、2.060 0 ng·mL-1和5.150 0 ng·mL-1黄曲霉毒素M1标准系列进样分析，以黄曲霉毒素M1浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，黄曲霉毒素M1在0.051 5～5.150 0 ng·mL-1线性关系良好，线性方程为Y=4.00×105X-8.74×103，相关系数为0.999 867。

2.3 方法的检出限和定量限

以3倍基线噪音时的浓度为检出限衡量指标（S/N≥3），黄曲霉毒素M1在0.02 μg·kg-1浓度添加量的信噪比（S/N）12.06＞3。以10倍基线噪音时的浓度为定量限衡量指标（S/N≥10），黄曲霉毒素M1在0.05 μg·kg-1添加量的信噪比38.62＞10。方法的检出限、定量限符合《食品安全国家标准 黄曲霉毒素M1的测定》（GB 5009.24—2016）的规定。

2.4 方法回收率和精密度

准确称取空白样品3组，每组6份，分低、中、高3个浓度水平进行加标，加标量为0.07 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1，按照1.4步骤处理后进行测定，计算平行样品黄曲霉毒素M1测定结果的回收率和精密度，结果见表1。《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F.1回收率中规定被测组分含量＜0.1 mg·kg-1，回收率在60%～120%；附录F.3精密度中规定被测组分含量≤0.1 μg·kg-1时，变异系数＜43%，被测组分含量在0.1～1.0 μg·kg-1时变异系数小于30%[11]。本实验平均加标回收率为81.0%～90.3%，变异系数为0.72%～3.18%，符合要求。

2.5 正确度

选用中国检验检疫科学研究院测试评价中心的能力验证样品进行黄曲霉毒素M1的检测，检测结果见表2。由表2可知，本实验室与能力验证样品指定值的检测偏差为0.36%，说明该方法正确度较好。

2.6 样品分析

《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中规定婴幼儿配方食品黄曲霉毒素M1不得超过0.5 μg·kg-1[12]。随机抽取某公司的婴幼儿配方产品3批次，使用该方法进行黄曲霉毒素M1的测定，结果均为未检出（＜0.02 μg·kg-1），检测结果符合限量要求。

3 结论

本文建立了测定婴幼儿配方奶粉中黄曲霉毒素M1的超高效液相色谱法，结果表明该方法的检出限、定量限、回收率、精密度及正确度较好，能够用于婴幼儿配方奶粉中黄曲霉毒素M1的准确测定。

参考文献

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[11]国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：国家标准出版社，2008.

[12]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：国家标准出版社，2017.

作者简介：杨雅雯（1987—），女，江西九江人，本科，助理工程师。研究方向：食品检测。