固相萃取—超高效液相色谱—串联质谱法测定解郁安神颗粒中8种非法添加化学药物的实验研究

李应才

【摘 要】 目的：建立解郁安神颗粒中8种非法添加药物的固相萃取-超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱检验方法。方法：样品经提取和固相萃取净化后，采用 Agilent C18色谱柱，流动相梯度洗脱，电喷雾离子源电离，正离子多反应监测扫描模式（MRM）定性和定量分析。结果：8种药物成分线性相关系数均>0.9995，检出限均低于2.6ng/ml，回收率为87%～97%。结论：该方法能有效去除基质干扰，检出限低、线性及回收率良好，适用于解郁安神颗粒中8种非法添加药物的检验。

【关键词】 解郁安神颗粒；固相萃取；超高效液相色谱-串联质谱；化学药物

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）12-0030-03

Abstract：Objective The establishment of Jieyu Anshen granules in 8 kinds of prohibited drugs in solid phase extraction high performance liquid chromatography - three four MS / MS test series. Methods The samples were extracted and purified by Agilent solid phase extraction， C18 column， mobile phase gradient elution， electrospray ionization， positive ion multiple reaction monitoring （MRM） scan mode of qualitative and quantitative analysis. Result 8 kinds of drug ingredients linear correlation coefficient （R） were greater than 0.9995， the detection limit is lower than 2.6 ng/ml，the recovery rate of 87%-97%. Conclusion This method can effectively eliminate matrix interference， low detection limit， linearity and good recovery rate， suitable for adding 8 prohibited Jieyu Anshen granules drug test.

Keywords：Jieyu Anshen granules； Spe； UPLC-ms/ms； Chemical drugs

解郁安神颗粒收载于2015年版中国药典一部[1]，具有疏肝解郁，安神定志的功效，常用于情志不畅、肝郁气滞所至的失眠、心烦、焦虑、健忘等症状。近年来不法分子为了片面追求疗效，可能在中成药中非法添加化学药物[2]。国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和项目批准件（批准件编号2009024）[3]中仅采用样品和标准品质谱图做比较来进行定性，缺少质谱参数及定量信息，使得在具体监督检验中缺少可操作性。解郁安神颗粒的处方由柴胡、大枣、石菖蒲、姜半夏、炒白术等16味中药组成，辅料为蔗糖。处方成分多，样品基质复杂，对检验其中可能非法添加的化学药物带来影响。研究采用固相萃取前处理，液相色谱串联质谱仪定性定量检测，能有效去除杂质，排除干扰，提高检出灵敏度，建立适合解郁安神颗粒中8种可能非法添加化学药物的检测方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 超Agilent 1290高效液相色谱仪；4000 QTPAP三重四级杆质谱仪 ；C18色谱柱（1.8μm×2.1mm×50mm，Agilent）；Generik C8/BCX固相萃取小柱（sepax）。

1.2 材料 奥沙西泮、地西泮、硝西泮、氯硝西泮、劳拉西泮、咪达唑仑、艾司唑仑、三唑仑对照品均购于中国食品药品检验研究院；解郁安神颗粒（批号：20150501，吉林百姓堂药业有限公司）。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制 分别精密称定各标准品约20mg置于50ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，于4℃冷藏，作为储备液。使用时用甲醇稀释至所需浓度。

2.2 混合对照品溶液 取上述各对照品储备液1.0ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 样品制备 取样品3g，研细，精密称定，置25ml具塞比色管中，加氯仿10ml，超声萃取30min，放冷，摇匀，将氯仿转移至小烧杯中，残渣再分别加10ml氯仿提取2次，转移至烧杯中，用氮气吹至近干，3ml甲醇溶解，作为样品提取液。

2.4 固相萃取方法 取固相小柱，分别用3ml甲醇和3ml 0.1mol/l乙酸溶液活化。将样品提取液加入固相柱，流速为1ml/min，用3ml 0.1mol/l乙酸溶液淋洗，用3ml 10% 氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近干，加 1ml甲醇定容，以备测定。

2.5 色谱条件 流动相为 0.1% 甲酸溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脱：0～3min，35%～38%B；3～5min，38%～39%B；5～16min，39%～40%B；16～17min，40%～65%B；17～19min，65%B；19～19.5min，65%～35%B；19.5～25min，35%B。流速：0.25ml/min；柱温35℃。

2.6 质谱条件 电喷雾正离子，MRM多反应监测扫描；气帘气，离子源雾化气，离子源辅助加热气，分别设定为25、55、55，喷雾电压为5500V，加热器温度为550℃，接口加热器打开。

2.7 样品测定 取固相萃取净化后的样品及加标样品溶液，进样量为1μl，照优化好的液相、质谱方法条件进行测定。

3 结果

3.1 质谱条件优化 分别用甲醇将8种对照品储备液稀释成约为1μg/ml的对照溶液，直接注射进样方式进样，分别扫描各对照品母离子Q1 和子离子Q3，优化离子质荷比、去簇电压、碰撞电压等参数，选用三个离子对作为定量和定性离子，建立8种药物混标的质谱检测方法。各成分优化结果见表1。

3.2 色谱条件优化 采用等度洗脱，后出峰的峰变宽，使方法灵敏度变低，检出限变高。采用梯度洗脱，同一梯度内，所有峰的峰宽是一致的。洗脱梯度大，则劳拉西泮和三唑仑无法完全分离，见图1。采用增加水相比例，降低梯度的方式，使二者有效分离开来。液相条件优化后，8种药物总离子流色谱图，见图2。

3.3 固相萃取条件优化 如果样品只用甲醇溶解，则上样后劳拉西泮有部分随甲醇流出，见图3。用超纯水淋洗，则淋洗液中也会带出氯硝西泮和劳拉西泮，见图4。用5%氨化甲醇洗脱，有部分奥沙西泮和劳拉西泮残留在柱子里，见图5。本文优化了条件，采用甲醇和0.1mol/L的乙酸溶液进行活化，用3ml 0.1mol/L乙酸溶液淋洗。各成分回收率均大于95%，见图6。

3.4 标准曲线的绘制 取混合对照品溶液逐级稀释，照上述液质联用条件测定。按S/N=3，计算各成分检出限；同一浓度连续进5针，计算保留时间及峰面积的相对标准偏差，评价精密度；系列各浓度平行进样2针，以峰面积对浓度做线性回归，得回归方程和相关系数，见图7。

3.5 样品的测定 取样品3g，按上述条件处理上机测定，计算回收率，见图8。将各成分所得参数统计，结果见表2。

4 讨论

C8/BCX为阳离子混合型固相萃取柱，所检测物质为弱碱性，使样品成酸性，使被检测物带 H+，有利于和固相柱的苯磺酸离子结合，洗脱液呈碱性，则有利于置换出目标物质。研究建立的实验方法，提取完全、净化干净、检出限低，定量定性准确，能有效用于开展该类药物中非法添加这几种化学物质的监督检验。

参考文献

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（收稿日期：2016.04.21）