超高效液相色谱光电二极管阵列检测串联四级杆质谱法测定红洋葱中黄酮醇及其糖苷类化合物

2014-12-16张维冰王智聪张凌怡��

分析化学 2014年3期

张维冰+王智聪+张凌怡��

摘要采用ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱，以含0.1%甲酸的乙腈水为流动相，0.3 mL/min 梯度洗脱方式辅以光电二极管阵列检测串联四级杆质谱进行定性与定量分析，建立了一种同时测定红洋葱中13种黄酮醇及其糖苷类化合物的方法，其中包含6种槲皮素及其糖苷、4种异槲皮素及其糖苷和3种山奈素及其糖苷。结果表明，红洋葱中主要的黄酮醇及黄酮醇糖苷类化合物是槲皮素 4′ 葡萄糖糖苷、槲皮素 3，4′ 二葡萄糖糖苷、槲皮素和异槲皮素 4′ 葡萄糖糖苷。红洋葱的不同部位黄酮醇及其糖苷的含量和分布并不一致，以干燥品计算，在相同质量的各部位中，最外两层、第三层和内层中总黄酮醇及其糖苷含量的比例为60.3∶33.0∶6.7，其中各部位槲皮素及槲皮素糖苷占黄酮总量的92.1%以上；最外两层中黄酮醇单糖糖苷含量最大，第三层中黄酮醇苷元含量最大，而内层中黄酮醇二糖糖苷含量最大。另外，在红洋葱中还发现了少量的山奈素及其糖苷，主要存在于洋葱外层中。本方法简单快速、准确性好，可用于洋葱产品中黄酮醇及其糖苷类化合物的分析。

关键词超高效液相色谱光电二极管阵列检测串联四级杆质谱；黄酮醇；黄酮醇糖苷；红洋葱

1 引言

洋葱，又称葱头、圆葱，属百合科葱属草本植物。洋葱不仅营养价值高，而且还有降血压、软化血管、抗糖尿病、改善肝脏机能等作用，这些生理功能主要是由于洋葱中含有多种具有抗氧化活性的黄酮类物质[1～4]。黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类多酚物质，多以糖苷形式存在，还有一部分以游离的苷元形式存在。目前对洋葱中黄酮类化合物的检测方法主要有紫外可见分光光度法[5，6]、毛细管电泳法[7]、高效液相色谱法[8～11]和液相色谱质谱联用法[12～15]等。已有关于国外产地的洋葱中（如韩国[12]、意大利[13，15]、美国[14]等）黄酮醇及其糖苷成分分析的报道，但很少看到中国国产洋葱中多种黄酮醇及其糖苷类化合物的分析。文献＼[5，6]使用紫外可见分光光度法测定了洋葱皮中总黄酮的含量；王大力等[8，9]通过酸水解法，将黄酮醇糖苷转化成相应的苷元，利用高效液相色谱法测定了洋葱中槲皮素、异槲皮素和山奈素，又通过制备色谱分离纯化，鉴定了槲皮素和槲皮素 4′ 葡萄糖苷。但对其它黄酮醇糖苷成分并未分析，同时也未见国产洋葱各部位如洋葱皮及可食部分中黄酮类化合物分析的报道。研究国产洋葱的化学组成，对洋葱品质研究及衍生产品的质量控制等具有重要意义。本研究鉴定了红洋葱中13种黄酮醇及其糖苷的可能结构，如表1所示，并分析了黄酮类化合物在红洋葱各部位的分布情况。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ACQUITY超高效液相色谱质谱系统，配光电二极管阵列检测器及三重四级杆质谱检测器（美国Waters公司）；AG285型精密电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；5810R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）； Milli Q超纯水器（美国Millipore公司）；KQ 100DE型数控超声波清洗器（中国昆山超声仪器有限公司）。

甲醇、乙腈和甲酸（色谱纯，德国Merck公司）； Quercetin， Quercetin 3 glucoside， Quercetin 4′ glucoside， Isorhamnetin， Kaempferol和Kaempferol 3 glucoside（美国Sigma 公司）；Quercetin 3，4′ diglucoside和Isorhamnetin 3 glucoside（中国J&K公司）。实验用水为Milli Q制备的超纯水。红洋葱购自上海当地菜市场。

2.2 标准溶液的配制

准确称取适量Q， Q 4′ G及Q 3，4′ dG固体标准品，加适量甲醇超声溶解，配制1000 mg/L的母液。用50%甲醇逐级稀释，配制5， 10， 15， 25， 50 mg/L的混合标准品工作溶液。

2.3 供试样品的制备

取适量大小均一、外表干净完整的红洋葱样品，剥取第一、二层（S1），再剥取第三层（S2），剩下内层样品（S3）切成5 mm × 5 mm左右的碎块，对上述3组样品，自然晒干，再置于50 ℃烘箱干燥至恒重。将上述恒重的3组样品，粉碎，过筛（筛孔尺寸： 0.85 mm × 0.85 mm）。分别精确称取筛下物0.8 g于15 mL带盖螺口玻璃试管中，分别加入10 mL 80%甲醇，浸泡30 min后超声萃取10 min，以4000 r/min离心10 min，收集上清液，残渣再用5 mL 80%甲醇重复提取3次，合并上清液，用50%甲醇适当稀释，0.22 μm PTFE针式过滤器过滤后供液相色谱质谱分析，每个样品平行制备两次。

2.4 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（150 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）；柱温为35 ℃；自动进样器温度为15 ℃；流速为0.3 mL/min；进样体积为2 μL；流动相A为含 0.1%（V/V）甲酸溶液；流动相B为含 0.1%（V/V）甲酸的乙腈溶液；梯度程序为：0～5 min， 5% B； 5～8 min， 5%～15% B； 8～12 min， 15%～17% B； 12～15 min， 17%～24%B； 15～17 min， 24%～26% B； 17～20 min， 26%～35% B； 20～23 min， 35%～60% B； 23～26 min， 60%～95% B； 26 28 min， 95% B； 28～28.1 min， 95%～5% B； 28.1～30 min， 5% B；紫外检测波长为360 nm ，波长扫描范围为200～500 nm。

2.5 质谱条件

在化合物的定性识别中，采用ESI电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压为3.0 kV，离子源温度为150 ℃，脱溶剂气（氮气）温度为400 ℃，雾化气（氮气）流速为600 L/h，锥孔气（氮气）流速为50 L/h，碰撞气（氩气）流速为0.13 mL/min，对各目标组分进行子离子扫描，质荷比范围为m/z100～800，碰撞电压为35 V，裂解电压为12 V； 0～5 min阀切换到废液。

3 结果与讨论

3.1 色谱分离

在优化的分离条件下，红洋葱样品（最外两层，S1）的色谱图如图1所示，其中峰高较小的部分组分A、B、C如放大区域所示。

3.2 洋葱中黄酮醇及黄酮醇糖苷的识别

采用超高效液相色谱光电二极管阵列检测串联四级杆质谱联用技术对图1中的色谱峰进行识别。峰3， 5， 8和11分别通过标准品比对保留时间及质谱参数，确认为Q 3，4′ dG， Q 3 G， Q 4′ G及Q。峰1的分子离子峰＼[M+H]+为m/z789，子离子扫描如图2a所示，其中m/z627为失去一分子葡萄糖的碎片离子＼[M-Glu]+，m/z465为失去两分子葡萄糖的碎片离子＼[M-2Glu]+，m/z 303为失去三分子葡萄糖的碎片离子＼[M-3Glu]+，其中m/z303也为槲皮素苷元的特征离子，峰3识别为Q 3，7，4′ tG。峰2的质谱参数与Q 3，4′ dG一致，其分子离子峰＼[M+H]+为m/z627，子离子扫描如图2b所示，其中465为失去一分子葡萄糖的碎片离子，m/z303为失去两分子葡萄糖的碎片离子。同时结合文献，可知Q 7，4′ dG的保留时间比Q 3，4′ dG短[12，13]，而Q 3，4′ dG已通过标准品确认保留时间为11.97 min，因此保留时间11.16 min 的峰2识别为Q 7，4′ dG。另外，峰1的紫外吸收光谱在343和265 nm有最大吸收，峰2的紫外吸收光谱在365和253 nm有最大吸收，如图3a和3b所示，其特征吸收峰与文献＼[12，13]报道的紫外光谱参数一致。

峰6和12通过标准品比对保留时间和质谱参数，分别确认为K 3 G和K。峰9的质谱参数与K 3 G一致，其分子离子峰＼[M+H]+为m/z449，子离子扫描如图2e所示，287为失去一分子葡萄糖的碎片离子，其中287也为山奈素苷元的特征离子。对洋葱中的山奈素糖苷，文献报道的山奈素糖苷中葡萄糖只在3位或4′位连接[16]，而K 3 G已通过标准品确认保留时间是16.44 min，因此保留时间17.21 min的峰9为K 4′ G。

3.3 洋葱中黄酮醇及黄酮醇糖苷的定量方法

由于缺乏所有黄酮醇糖苷的标准品，文献中对黄酮醇糖苷的定量多采用槲皮素当量的方法来表示。但是，无论在紫外检测还是质谱检测中，各化合物的信号响应并不一致，尤其在质谱检测中，黄酮醇单糖糖苷与二糖糖苷及三糖糖苷的响应差异较大，势必给各化合物的定量造成误差。本研究采用相似的计算方法，引入了摩尔信号响应因子的概念，即相同摩尔质量的化合物j与标准品i在相同条件下检测信号的比值，用Fi，j表示，通过Fi，j即可校正因化合物与标准品信号响应差异造成的误差，如公式（1）所示。由于样品中各组分的浓度差异较大，如果采用质谱进行定量分析，很难保证所有化合物均落入标准品的线性范围之内，如果加大样品的稀释比例，含量较低的组分则由于稀释倍数太大而检测不到。实验中采用紫外法进行定量分析，同时兼顾了高浓度与低浓度样品的检测与定量分析。由于黄酮醇及黄酮醇糖苷结构相似，在352～385 nm和245～270 nm有最大吸收，采用360 nm的波长进行检测，同时定量计算中采用了摩尔信号相应因子，最大限度减小了各化合物信号响应差异造成的误差。

3.4 红洋葱中黄酮醇及黄酮醇糖苷的含量及分布

对2.3节制备的3组洋葱样品进行测定，并按照公式（1）进行计算，结果如表2所示，其中各组分的含量均以两次测定的平均值（Mean）± 重复测定的标准偏差（SD）表示。

从表2可见，以干燥品计算，在相同质量的红洋葱不同部位中，无论总黄酮醇及其糖苷，还是总槲皮素及其糖苷、总异槲皮素及其糖苷和总山奈素及其糖苷，最外两层（S1）中含量均最大，约为总量的60%，其次为第三层（S2），均约为总量的34%，而内层可食部分（S3）的黄酮醇及其糖苷含量最少，均约为总量的6%，如图4所示。进一步比较红洋葱不同部位各种类黄酮醇及其糖苷的分布，发现各部位总槲皮素及其糖苷占黄酮总量的92.1%～93.7%，总异槲皮素及其糖苷占5.2%～6.4%，总山奈素及其糖苷占0.5%～1.5%。可见，不论是洋葱的外层还是内层，槲皮素及其糖苷的含量最大，而山奈素及其糖苷的含量最小。对槲皮素类化合物，含量较高的是Q， Q 4′ G及Q 3，4′ dG，不论在红洋葱的哪个部位其含量均大于总槲皮素及其糖苷含量的94.5%；对异槲皮素类化合物，含量较高的是IR，IR 4′ G及IR 3，4′ dG，其含量均占到总异槲皮素及其糖苷含量的93.7%以上。

另外，比较红洋葱不同部位各黄酮醇苷元与其单糖糖苷及二糖糖苷所占的比例发现，在红洋葱最外两层（S1）中，总黄酮醇苷元占黄酮总量的22.9%，总黄酮醇单糖糖苷占57.0%，总黄酮醇二糖糖苷为19.8%；在洋葱第三层（S2）中，总黄酮醇苷元占46.3%，总黄酮醇单糖糖苷为30.5%，总黄酮醇二糖糖苷为23.2%；而在洋葱内层（S3）中，总黄酮醇苷元占9.1%，总黄酮醇单糖糖苷为39.9%，总黄酮醇二糖糖苷占49.5%。如图5所示，在洋葱最外两层中，黄酮醇单糖糖苷含量最大；在洋葱第三层中，黄酮醇苷元含量最大；在洋葱内层中黄酮醇二糖糖苷含量最大，黄酮醇苷元含量最小。

洋葱中主要的黄酮醇及其糖苷类化合物是Q 4′ G，Q 3，4′ dG，Q及IR 4′ G，与文献报道的红洋葱中主要的黄酮醇糖苷类似，但各组分的含量大小有差异。如韩国和意大利红洋葱中主要的黄酮醇糖苷是Q 3，4′ dG，Q 4′ G和IR 4′ G[12，13]，其中Q的含量很低。本研究发现，红洋葱的外层中黄酮醇苷元的含量较高，如最外两层中黄酮醇苷元为黄酮总量的22.9%，第三层甚至达到46.3%。Lee等[14]在研究黄洋葱时发现外层中Q为总量的6%，而内层却不含Q，与本研究结果相似。本研究测定的红洋葱中Q的含量与文献报道有较大差异，可能与样品前处理方式有关，在上述文献中均去掉了外层，而外层中Q的含量非常高，因此导致上述文献结果中黄酮醇苷元的含量较低。另外，洋葱中山奈素及其糖苷的报道较少[16]，而本研究发现红洋葱中含有K，K 3 G和K 4′ G，主要存在于洋葱的外层，如最外两层中总山奈素及其糖苷的含量为黄酮总量的1.5%，第三层为1.4%，内层为0.5%。洋葱中黄酮醇及其糖苷含量的差异不仅与洋葱的种类有关，还与洋葱的产地、生长环境、储藏条件等有关[16～21]。

4 结论

本研究建立了超高效液相色谱光电二极管阵列检测串联四级杆质谱法测定红洋葱中黄酮醇及其糖苷类化合物的方法。通过联用的紫外光谱及质谱检测器，鉴定了13种黄酮醇及黄酮醇糖苷。结果显示红洋葱中主要的黄酮醇及黄酮醇糖苷类化合物是Q 4′ G， Q 3，4′ dG， Q及IR 4′ G，其中各部位中槲皮素及槲皮素糖苷为黄酮总量的92.1%以上；并且在红洋葱外层及内层中，黄酮醇及黄酮醇糖苷分布不一致，最外两层中黄酮醇单糖糖苷含量最大，第三层中黄酮醇苷元含量最大，而内层中黄酮醇二糖糖苷含量最大；另外，在红洋葱中还发现了少量的山奈素及其糖苷，主要存在于洋葱外层。所建立的方法不仅可用于红洋葱的分析，同样适用于其它品种如黄洋葱、白洋葱等产品的分析。研究中国国产本地洋葱的化学组成，对新品种的培育、产品质量控制、活性成分的生理作用研究，以及洋葱皮副产物的加工利用等具有重要意义。

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