基于SPME-GC-MS和电子鼻技术对牛肉蛋白肽美拉德反应产物风味成分分析

桂海佳 任丽蓉 王晓华 李泽林 谷大海 王雪峰 肖智超 王桂瑛 范江平

摘要：拟探究不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应产物的风味特性。以牛肉边角料为原料，经酶解后采用液相串联质谱（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）对其酶解液中肽分子量及分布进行分析；再以不同肽段的牛肉蛋白肽为基料进行美拉德反应，利用电子鼻技术（electronic nose，E-nose）、氨基酸自动分析仪、顶空固相微萃取法-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS），结合偏最小二乘法判别分析，分析不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应产物（BPM）的挥发性风味物质。结果表明，在未分肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应液（BPMS）中共鉴定出68种挥发性成分；牛肉蛋白肽美拉德反应液最佳肽段为1～3 kDa （BPM 1～3），BPM 1～3的肽段经过美拉德反应后亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸含量明显增加，从BPM 1～3中共鉴定出50种挥发性成分，包括醇类、酮类、酯类、杂环类、烷类、醛类等；BPMS与BPM 1～3共有14种挥发性化合物差异较明显。

关键词：牛肉蛋白肽；美拉德反应；HS-SPME-GC-MS；电子鼻；偏最小二乘法判别分析

中图分类号：TS201.21      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）05-0160-07

Abstract： The purpose of this study is to investigate the flavor characteristics of Maillard reaction products of beef protein peptides with different peptide segments. With beef offals as the raw materials， the molecular weight and distribution of peptides in the hydrolysate are analyzed by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） after enzymatic hydrolysis; and then different beef protein peptides are used as the basic materials for Maillard reaction. The volatile flavor substances of different beef protein peptide Maillard reaction products （BPM） are analyzed by electronic nose （E-nose）， automatic amino acid analyzer， headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） and partial least squares discriminant analysis. The results show that 68 volatile components are identified in the unsegmented beef protein peptide Maillard reaction solution （BPMS）.The optimal peptide segment of beef protein peptide Maillard reaction solution is 1～3 kDa （BPM 1～3）， and the content of leucine， tyrosine， phenylalanine  and arginine

收稿日期：2022-11-11

基金項目：云南省专家工作站（202005AF150016）；校企合作项目（KX142021018）

作者简介：桂海佳（1996-），女，硕士，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：范江平（1972-），男，教授，博士，研究方向：食品科学。

in the peptide segment of BPM 1～3 increases significantly. Fifty volatile components are identified in BPM 1～3， including alcohols， ketones， esters， heterocycles， alkanes， aldehydes and so on. There are 14 significantly different volatile compounds in BPMS and BPM 1～3.

Key words： beef protein peptide; Maillard reaction; HS-SPME-GC-MS; electronic nose; partial least squares discriminant analysis

牛肉作为我国第二大肉类消费品，其肉质鲜美，富含蛋白质、矿物质、B族维生素等多种营养成分[1]，还具有低脂肪、低胆固醇等优点[2—5]。在牛肉加工以及零售过程中会产生大量的边角料，这些边角料和牛肉营养差别较小，但是在市场上利用率低，其利用的方式较单一，包括工业油、重组牛肉制品、肥料及燃料等，未将牛肉边角料的营养价值充分利用，造成资源浪费、环境污染、碳排放超标等问题。牛肉边角料中的蛋白肽可以作为呈味肽的良好来源，将其运用到调味品中，将有利于提高牛肉加工的附加值，获得良好的经济效益。

目前获得牛肉蛋白肽的处理方法主要包括酶解法、化学法及微生物发酵法等，其中酶解法是最环保、安全、高效的方法。酶解可以将蛋白质水解成多肽、游离氨基酸，更有利于人体消化吸收，降解后的活性多肽具有降低胆固醇、降血脂、抗氧化等多种生物活性[6—10]。美拉德反应主要指羰基化合物（醛类、酮类以及还原糖类）和氨基化合物（氨基酸、多肽和蛋白质等含氮化合物）之间的反应[11—12]。它能够为食品提供诱人的色泽和愉快的香气，使食物的香气醇厚饱满，减少食物本身的腥味，在食品风味形成和改善过程中起到重要作用，被广泛运用于天然肉类香精香料的生产中[13—14]。目前，对美拉德反应的研究主要集中于对游离氨基酸-美拉德反应体系或肽-美拉德反应体系，其中挥发性风味化合物、非挥发性呈味及呈色化合物都是美拉德反应研究的热点问题[15]。

结合牛肉边角料的综合利用情况，本研究以牛肉边角料作为原料，采用酶解及超滤手段得到不同肽段的牛肉酶解液，对其进行美拉德反应后，采用氨基酸分析、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术和电子鼻技术对美拉德反应液进行风味成分及聚类热图分析，结合偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），研究不同肽段美拉德反应液样品间风味组分差异，探究牛肉不同肽段的风味特性，可以丰富调味品种类，为实现标准化生产提供很好的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛肉（西门塔尔牛）边角料，剔除油脂较厚以及筋、腱较多的部分：昆明蒜村菜市场。葡萄糖（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；木糖（食品级）：上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖（食品级）：国药集团化学试剂有限公司；硫胺素（食品级）：上海曙光生物化学制品厂；L-半胱氨酸盐酸（食品级）：Biosharp 生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SPME仪器：7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪（GC-MS） 美国安捷伦公司；CTC三位一体自动进样器、PEN3电子鼻 德国Airsense公司。

1.3 试验方法

1.3.1 牛肉酶解工艺流程

牛肉边角料预处理→加水混匀→加入木瓜蛋白酶→水浴酶解→灭酶→加入风味蛋白酶→水浴酶解→灭酶→离心→取上清液备用。

酶解条件：木瓜蛋白酶：牛肉与水的比例为1∶1、酶解温度53 ℃、pH 7.0、酶解时间310 min、酶添加量3.5%；风味蛋白酶：牛肉与水的比例为1∶1、酶解温度51 ℃、pH 7.5、酶解时间210 min、酶添加量2.5%。

1.3.2 不同肽段分离纯化流程

酶解工艺优化后的牛肉酶解液经过离心后，将离心上清液过滤膜抽滤，得到澄清的蛋白质酶解液，一方面将澄清的蛋白酶解液经过美拉德反应，得到牛肉蛋白肽美拉德反应液（BPMS），另一方面将澄清的蛋白酶解液通过1，3，5 kDa滤膜超滤处理后，得到不同肽段的蛋白质酶解液，进行美拉德反应后得到不同肽段的美拉德产物<1 kDa（BPM 1），1～3 kDa（BPM 1～3），3～5 kDa（BPM 3～5），>5 kDa（BPM 5）。

1.3.3 美拉德反应工艺流程及褐变程度

在澄清的蛋白酶解液中加入5.0%等量的还原糖和木糖、1.4%半胱氨酸盐、温度118 ℃、时间54 min。利用紫外分光光度计测定经美拉德反应后的反应物在294，420 nm处的吸光度值，利用吸光值确定其褐变程度。

1.3.4 LC-MS/MS分子量分布测定

采用液相串联质谱（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對蛋白酶解液多肽含量以及分子量分布进行分析。

液相串联质谱分析：反相柱信息：C18柱；色谱仪器：EASY-nLC 1200；质谱仪器：Q_Exactive HF-X；色谱分离时间：90 min；A：2%乙腈+0.1%甲酸；B：80%乙腈+0.1%甲酸；流速：300 nL/min；梯度：MS扫描范围（m/z）：200～2 000。

1.3.5 电子鼻分析

试验流程：预热仪器30 min，启动自动清洗传感器120 s，检测样品流速为300 mL/min，信号采集60 s进行测定。

准确吸取20 mL美拉德反应液置于容量瓶中，密封静置20 min，当瓶中的气体达到平衡后进行检测。

1.3.6 游离氨基酸的测定

根据GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》的方法，采用氨基酸自动分析仪进行测定。

1.3.7 HS-SPME-GC-MS挥发性成分测定

采用顶空固相微萃取法分析BPMS和BPM 1～3的挥发性成分差异。样品处理方法及SPME-GC-MS条件参数参考桂海佳等[16]的测定方法及参数。

SPME条件：温度50 ℃；振荡速度和时间分别为250 r/min、15 min，萃取30 min；解吸及GC循环时间分别为5，50 min。

GC条件：进样和接口温度260 ℃；流量1 mL/min；柱温40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5 min。

MS条件：离子源及四级杆温度分别为230 ℃，150 ℃；质量范围20～400 amu；电离方式EI+，电子能量70 eV；NIST 2014谱库。

1.4 数据处理

每组试验重复3次，采用Origin 8.0进行试验数据处理；采用Design-Expert 8.0统计分析软件进行试验设计和结果分析；采用IBM SPSS Statistics 21.0进行试验数据差异显著性分析；采用电子鼻WinMuster软件进行相应PCA和LDA分析；试验数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 牛肉酶解液中多肽的分布

牛肉原料经酶解后的酶解液总离子流图见图1，牛肉蛋白酶解液通过液相串联质谱后不同肽段的相对分子量见图2。

由图2可知，>4 kDa的肽段所占含量较少，1～3 kDa的肽段含量较多。

2.2 不同牛肉蛋白肽美拉德反应产物的褐变

由图3可知，在294 nm条件下，4组肽段的吸光度值总体较高，BPM<1和BPM 1～3两组肽段产生的美拉德产物比BPM 3～5和BPM>5组略多；在420 nm条件下，BPM<1肽段组的吸光度值最高，BPM 1～3组次之。从吸光度方面分析来看，BPM<1、BPM 1～3肽段组美拉德反应较好。

2.3 不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应电子鼻检测结果

2.3.1 传感器区分贡献率分析

电子鼻Loadings分析是传感器对样品中挥发性物质进行区分的一种研究方法，主要考察样品中哪类气体物质起主要区分作用，并判别其贡献率大小。不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应Loadings分析见图4。

传感器W1W（对硫化物敏感）距x=0最远，说明W1W对第一主成分贡献率最大、响应值最高，说明产生了较多硫化物，含硫化合物被认为是形成肉香的重要化合物，能够为美拉德反应产物提供基础肉香，因此可以确定硫化物赋予牛肉蛋白肽美拉德反应液肉香；传感器W1S（对甲基类敏感）距y=0最远，说明W1S对第二主成分贡献率最大，其次为W2S（对醇类敏感）和W3C（对芳香成分敏感）；除W1W（对硫化物敏感）外，W2S、W1S及W5S（对氮氧化合物敏感）对第一主成分也有较大贡献率；综合以上结果，美拉德反应后香气物质的变化可能主要与硫化物、醇类、芳香类及氮氧类等挥发性物质有关。

2.3.2 主成分分析结果

不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应产物距离越远说明二者之间的气味差异性越大。由图5可知，两个主成分累计贡献率为99.3%，远大于80%，说明该模型能够很好地反映原始数据。4个不同肽段美拉德反应产物数据点均没有重叠，表明不同肽段的牛肉蛋白肽在经过美拉德反应后会产生不同的风味。

结合蛋白肽的含量和美拉德褐变程度，采用BPM 1～3肽段组美拉德反应物和未分段的牛肉蛋白肽美拉德反应液（BPMS）对比呈味特性，开展差异研究。

2.3.3 BPMS、BPM 1～3游离氨基酸含量对比分析

由表1可知，BPM 1～3的肽段经过美拉德反应后，亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸含量明显增加。与此同时，本身具有鲜味特征或者为鲜味肽的组成氨基酸的谷氨酸、组氨酸、丙氨酸等均有不同程度的增加，说明经过超滤分离出BPM 1～3的牛肉蛋白肽在美拉德反应后增强其鲜味特征。对比必需氨基酸的含量，除缬氨酸外，其余必需氨基酸含量都有不同程度的增加，说明筛选肽段的方式对提高牛肉蛋白肽呈味特性和营养价值具有可行性。

2.4 BPM 1～3与BPMS的比较

2.4.1 挥发性成分的比较

采用顶空固相微萃取结合GC-MS分析反应产物的挥发性成分组成，见表2。

从BPMS中共鉴定出68种挥发性成分，包括醇类12种、酮类4种、酸类2种、酯类3种、烯类2种、酚类1种、杂环类13种、烷类11种、醛类7种、醚类2种、其他类11种。从BPM 1～3中共鉴定出50种挥发性成分，包括醇类8种、酮类3种、酸类1种、酯类3种、杂环类11种、烷类6种、醛类7种、醚类4种、其他类7种。二者美拉德反应产物的主要挥发性成分包括醇类、酮类、杂环类、醛类、烷类；其中经过肽段筛选后，发现醇类含量总体升高（如乙醇、糠（基）硫醇、甲硫醇等），醛类、烷类、杂环类含量总体降低（如苯乙醛、異戊醛、三氯甲烷、2，4-二甲基己烷、嘧啶、哒嗪等）。而乙醇、糠（基）硫醇、丙酮醇、蘑菇醇、芳樟醇等呈现蘑菇香味或者其他香味的醇类，具有水果香气的乙酸乙酯，有肉类香气的吡嗪类杂环物质，烷类物质大多香气较弱或无味，但烃类化合物可能作为杂环类化合物的重要中间体对风味形成具有基底作用。烯烃类化合物可作为醛类、酮类的前体物质对风味形成具有潜在作用。说明经过肽段筛选后，香味物质更加浓郁。

2.4.2 偏最小二乘法判别分析

采用SIM CA-P 11.5对两组样品香气组分进行偏最小二乘判别分析，以挥发性组分的相对含量为自变量，建立PLS-DA模型。由图6可知，BPMS与BPM 1～3可明显区分，证明两组样品各有差别并且模型稳定性较好。

2.4.3 差异代谢物聚类及其显著性差异代谢物分析

醛类物质的主要来源是脂肪的降解和氧化，醛类物质可以赋予肉类特殊的脂肪香味，尽管醛类化合物相对含量较低，但其阈值也较其他风味物质低，因此它是肉类中主要的风味贡献物质[17]。杂环类物质大都具有很强的肉香味以及极低的香气阈值，主要有呋喃、吡咯、吡嗪和噻唑，如2-乙酰基噻唑具有牛肉香气，大多数呋喃类化合物呈现似焦糖味、肉香味、焦香味、水果香味以及坚果味，具有增香的作用[18]。而噻唑类化合物是烤肉和炸肉类风味的重要组分，阈值很低，具有坚果香[19]。醇类化合物中不饱和醇阈值较低，对产品风味贡献较高，饱和醇则对肉品风味影响不显著，但总体而言，醇类化合物在肉制品风味中无较大贡献，一般是由脂肪氧化分解以及醛酮类化合物还原所得[20—23]。

两组挥发性风味组分间存在差异，选择同时具有多维统计分析变量权重值（VIP>1）且单变量统计分析（P<0.05）的化合物，对具有显著性差异的化合物进行聚类热图分析（见图7），发现BPMS与BPM 1～3的香气主要在乙醇、糠（基）硫醇、丙酮醇、蘑菇醇、芳樟醇、乙酸乙酯、4-甲基-5-羟乙基噻唑、2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、噻喃、十甲基环五硅氧烷、三氯甲烷、异戊醛、苯乙腈14种化合物中差异较明显，其中乙醇、糠（基）硫醇、噻喃3种化合物在BPM 1～3中含量更高，呋喃、吡嗪类等其余11种化合物与BPM相比都有一定程度的降低。

3 结论

电子鼻能够较好地区分不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应产物，且不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应产物的香气差异较大。通过筛选肽段，分离出1～3 kDa的牛肉蛋白肽在美拉德反应后，除缬氨酸外，其余必需氨基酸含量都有不同程度的增加，说明筛选肽段的方式可能具有提高牛肉蛋白肽的呈味特性和营养价值的作用。

对比挥发性风味成分发现，1～3 kDa肽段的美拉德反应产物（BPM 1～3）与未分肽段的牛肉蛋白肽美拉德反应液（BPMS）的挥发性风味成分差异较大，从BPMS中共鉴定出68种挥发性成分；从BPM 1～3中共鉴定出50种挥发性成分；对比二者的挥发性成分，共14种挥发性化合物差异较明显，说明肽段筛选的方式能有效改变牛肉蛋白肽挥发性成分组成。

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