基于Lactate?鄄NAD?鄄LDH模型响应面优化肉制品中亚硝酸盐和肌红蛋白量效关系

谢政泽 李玉涵 王琪 向杰 陈韬

摘要：为降低肉制品加工时的亚硝酸盐添加量，在Lactate-NAD-LDH模型下采用单因素试验和響应面设计，探究肌红蛋白与亚硝酸盐的量效关系，以及pH、温度、D-异抗坏血酸钠添加量对量效关系的影响。结果表明，pH和反应温度对a*值、亚硝基肌红蛋白生成量和亚硝酸盐残留量影响显著，存在显著的交互作用。亚硝基肌红蛋白生成量最大（59.71 g/100 g）时的条件为pH 6.5、温度50 ℃、D-异抗坏血酸钠添加量0.07%，此时a*值为14.92，10 mg肌红蛋白在此条件下消耗亚硝酸盐的量为0.204 mg。此量效关系可为降低亚硝酸盐添加量提供新思路和依据。

关键词：肌红蛋白；亚硝酸盐；量效关系；色泽；响应面

中图分类号：TS251.1      文献标志码：A  文章编号：1000-9973（2023）05-0017-07

Abstract： In order to reduce the addition amount of nitrite during meat product processing， single factor test and response surface design are used under Lactate-NAD-LDH model to explore the dose-effect relationship between myoglobin and nitrite， as well as the effects of pH， temperature and sodium D-isoascorbate addition amount on the dose-effect relationship. The results show that pH and reaction temperature have significant effects on a* value， nitrosomyoglobin production amount and nitrite residue amount， and there is significant interaction effect. The conditions for the maximun production of nitrosomyoglobin （59.71 g/100 g） are as follows： pH is 6.5， temperature is 50 ℃， and sodium D-isoascorbate addition amount is 0.07%. At this time， a* value is 14.92， and the consumption amount of nitrite by 10 mg myoglobin is 0.204 mg under these conditions. The dose-effect relationship can provide new ideas and basis for reducing the addition  amount of nitrite.

Key words： myoglobin; nitrite; dose-effect relationship; color; response surface

收稿日期：2022-11-19

基金项目：云南农业大学科研发展基金项目（KX900127000）

作者简介：谢政泽（1997－），男，硕士，研究方向：畜产品加工与品质控制。

*通信作者：陈韬（1963－），男，教授，博士，研究方向：畜产品加工与品质控制。

腌腊肉制品加工时添加亚硝酸盐具有发色[1-2]、抑菌[3-4]、抗氧化[5]、改善质构[6]等作用，同时还能使肉制品产生特殊的腌制风味[7-8]，然而亚硝酸盐在一定条件下会生成具有致突变性和致癌性的N-亚硝基化合物[9-12]。因此，亟需寻找高效、安全降低亚硝酸盐添加量的方法。国内外学者针对如何降低亚硝酸盐添加量展开了相关研究，目前降低亚硝酸盐添加量的方法主要为替代法[13]，主要的替代物质有红曲红色素、番茄红素、甜菜红[14]等天然色素[15-16]。然而替代所用的色素在光和金属离子的作用下，大多数都具有不稳定性[17-18]，且不能产生亚硝酸盐特有的风味[19-20]，达不到完全替代亚硝酸盐的作用。所以，如何降低亚硝酸盐添加量且保证亚硝酸盐在肉制品加工中的作用成为业界十分关注的问题。

在肉制品加工中，亚硝酸盐的添加量通常参照国标添加量和实践经验来确定，鲜见有人从亚硝酸盐与肌红蛋白的量效关系上进行研究。McClure等[21]发现，亚硝酸盐和肌红蛋白在有还原物质的条件下才会发生反应，所以需构建一个综合的还原模型，以模型研究的思路来探讨亚硝酸盐和肌红蛋白的量效关系[22]。肉中的还原反应体系除了还原酶之外，还有其他反应介质及细胞器的参与，Bekhit等[23-25]在真空包装的鲜肉表面观察到MetMb（高铁肌红蛋白）的还原，提出肉中存在天然的还原系统Lactate-NAD-LDH，该系统中包含lactate（乳酸）、NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、LDH（乳酸脱氢酶）、PMS（5-甲基吩嗪硫酸甲酯）等物质。

本研究运用单因素试验与响应面设计在Lactate-NAD-LDH模型下探究肌红蛋白和亚硝酸盐的量效关系以及pH、温度、D-异抗坏血酸钠添加量的变化对体系a*值、亚硝基肌红蛋白（NOMb）生成量和亚硝酸盐残留量的影响，优化了最佳反应条件，以期为肉制品生产加工过程中降低亚硝酸盐添加量提供思路及依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肌红蛋白（纯度＞95%）、NAD、亚硝酸盐含量检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；亚硝酸钠（分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；D-异抗坏血酸钠：盛达食品有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：天津市风船化学试剂有限公司；乳酸钠：罗恩试剂；LDH、PMS：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

R-Biopharm EL1酶标仪 Thermo Scientific公司；CR-400色差仪 日本美能达公司；HH-8水浴锅 金坛市城西峥嵘实验仪器厂；HC-3018R台式高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；HJ-3磁力搅拌器 江苏金坛医疗仪器厂；HI9025C便携式pH计 意大利哈纳（中国）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 亚硝酸盐最适添加量确定试验

Lactate-NAD-LDH模型参考McClure等[21]的方法建立，稍有修改。首先将肌红蛋白溶解在30 mmol/L磷酸缓冲液中，然后分别将乳酸钠（20 mmol/L）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（0.65 mmol/L）、乳酸脱氢酶（0.04 unit）、PMS（0.75 mmol/L）、亞硝酸盐加入溶液中，最后调节模型的pH至7.2，试验在室温（23 ℃）下进行。根据亚硝酸盐和肌红蛋白的化学反应，1 mg肌红蛋白需要0.006 1 mg亚硝酸盐，因原模型NOMb生成量较小，不方便测量，所以将Lactate-NAD-LDH模型中肌红蛋白的量增加到10 mg。为了让加入的肌红蛋白最大程度地参与反应，模型中亚硝酸盐的添加量设置为0.0，0.2，0.3，0.4 mg。在反应后于1，4，7，12 h分别测定亚硝酸盐残留量和NOMb生成量以确定最大添加量。

1.3.2 单因素试验

在Lactate-NAD-LDH模型下，考察模型pH、反应温度、D-异抗坏血酸钠添加量的变化对a*值和NOMb生成量的影响。通过预试验发现，模型a*值和NOMb生成量在反应开始的1 h内快速升高，达到最大值，反应1 h后下降，在后续反应时间内无明显变化，所以将反应时间设置为1 h、亚硝酸盐添加量设置为0.4 mg进行单因素试验，并确定响应面试验中各因素的最适考察范围。反应条件如下：

考察pH为5.0，5.5，6.0，6.5，反应温度为42 ℃，D-异抗坏血酸钠添加量为0.06%；考察D-异抗坏血酸钠添加量为0.05%、0.06%、0.07%、0.08%，反应温度为42 ℃，pH为5.5；考察反应温度为42，46，50，54 ℃，pH为5.5，D-异坏血酸钠添加量为0.06%。

1.3.3 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，以反应温度、pH、D-异抗坏血酸钠添加量为因素，以a*值、NOMb生成量、亚硝酸盐残留量为评价指标，设计三因素三水平响应面试验。响应面试验因素水平见表1。

1.3.4 指标测定

1.3.4.1 亚硝酸盐残留量的测定

使用北京索莱宝科技有限公司提供的亚硝酸盐含量检测试剂盒进行反应体系中亚硝酸盐残留量测定。

1.3.4.2 NOMb生成量的测定

参考Eyiler等[15]的方法，略有修改。反应溶液为80%丙酮和20%水，料液比1∶4，5 000×g离心5 min，取上清液测定吸光度。

总血红素（mg/kg）=A640×680，

NOMb（mg/kg）=A540×290，

NOMb生成量（g/100 g）=NOMb（mg/kg）总血红素（mg/kg）×100。

1.3.4.3 色泽的测定

反应体系色泽用便携式色差仪（Minolta Cameras CR-400，Japan）测量，将色差仪探头对准反应体系表面，记录反应体系的a*值，仪器使用前用标准板校正。重复测定3次取平均值。

1.4 统计分析

所有试验重复3次。采用SPSS Statistics 25对单因素试验结果进行方差分析和多重比较，响应面设计与分析采用Design Expert 8.0.6，采用GraphPad Prism 8.3.0软件绘图。结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐添加量对亚硝酸盐残留量、NOMb生成量的影响

由图1中A可知，随着反应时间的延长，所有组亚硝酸盐残留量均逐步降低，随着亚硝酸盐添加量的增加，反应体系中亚硝酸盐残留量也随之增加（P＜0.05）。各添加量组NOMb生成量见图1中B，添加0.2 mg 亚硝酸盐组的 NOMb生成量一直处于上升状态，在12 h时达到最大。添加0.3，0.4 mg 亚硝酸盐组，在7 h内NOMb生成量无明显变化，7 h后急剧上升，在12 h时达到最大。在反应7 h内亚硝酸盐添加量为0.2 mg组的NOMb生成量显著高于亚硝酸盐添加量为0.3，0.4 mg组，原因可能是当亚硝酸盐添加量大于0.2 mg时，在反应7 h内肌红蛋白会被亚硝酸盐氧化[26]，从而生成NOMb（Fe3+），7 h后在Lactate-NAD-LDH模型中NOMb（Fe3+）被还原，导致NOMb（Fe2+）的生成[27]。在12 h时未添加亚硝酸盐组的NOMb生成量显著低于添加亚硝酸盐组（P＜0.05），添加亚硝酸盐的组间NOMb生成量差异不显著（P＞0.05），考虑到后续试验有加热处理，且加热会导致亚硝酸盐分解，故选0.4 mg为后续试验亚硝酸盐添加量。

2.2 单因素试验

2.2.1 不同反应温度对亚硝酸盐残留量、NOMb生成量和a*值的影响

由图2中A可知，在各反应温度下，NOMb生成量随温度的升高呈现先增加后减少的趋势。50 ℃组的NOMb生成量最大（P＜0.05），这可能是由于该温度下亚硝酸盐分解增加[28]，产生了更多的NO，NO与Mb结合生成较多的NOMb[29]，与此对应的是该组的亚硝酸盐残留量（0.231 mg）显著低于其他试验组（P＜0.05）。有研究发现，50 ℃左右时乳酸脱氢酶的活性比较高，所以产生的还原物质会随之增加[30-31]，亚硝酸盐被还原，产生的NO也会随之增加，导致亚硝酸盐残留量下降。不同反应温度下的a*值见图2中B，50 ℃反应组的a*值显著高于其他温度组（P＜0.05），这与NOMb生成量结果一致。综合所有因素考虑，响应面优化试验温度选择46，50，54 ℃。

2.2.2 不同反应pH对亚硝酸盐残留量、NOMb生成量和a*值的影响

由图3中A可知，在不同pH条件下，NOMb生成量随pH的升高而增加，pH为6.5时NOMb的生成量达到最大值（P＜0.05），这可能与氧合肌红蛋白在不同pH条件下的存在状态有关。据刘越[32]报道，肌红蛋白在偏碱性条件下较稳定，酸性条件和极碱性条件都会促进肌红蛋白的氧化，pH越低，氧化速率越快。亚硝酸盐的残留量随pH的升高而降低，说明亚硝酸盐的还原速率与pH呈正相关，这可能与乳酸脱氢酶在不同pH环境下的活性有关[33-34]。NOMb生成量达到最大时，亚硝酸盐的残留量为0.235 mg。pH与a*值的关系见图3中B，反应体系的a*值随pH的升高而逐步升高，在pH为6.5时达到最大，且各pH组之间的差异显著（P＜0.05）。考虑到加工肉制品的pH一般在5.0～6.5左右，响应面优化试验pH选择5.5，6.0，6.5。

2.2.3 不同D-异抗坏血酸钠添加量对亚硝酸盐残留量、NOMb生成量和a*值的影响

由图4可知，随着D-异抗坏血酸钠添加量的增加，NOMb生成量和a*值差异均不显著（P＞0.05），但添加量为0.07%组的NOMb生成量和a*值较高，此时亚硝酸盐残留量为0.270 mg。综合所有因素考虑，响应面优化试验D-异抗坏血酸钠添加量选择0.06%、0.07%、0.08%。

2.3 响应面试验

响应面试验设计及结果见表2，根据响应面设计方案，对其进行方差分析，回归模型方差分析见表3～表5。

由表3～表5可知，NOMb生成量和a*值模型达到极显著程度（P<0.000 1），亚硝酸盐残留量模型达到较显著程度（P＜0.01），3个模型失拟项的P＞0.05，意味着失拟项对于纯误差不显著，决定系数分别为0.992 6，0.986 4，0.963 5，说明该模型拟合程度良好，误差较小，该回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的关系。反应温度（A）对NOMb生成量和a*值影响显著，对亚硝酸盐残留量影响较显著；pH值（B）对NOMb生成量、a*值和亚硝酸盐残留量影响极显著；D-异抗坏血酸钠添加量（C）对NOMb生成量影响显著，对a*值和亚硝酸盐残留量影响不显著。交互项AB对NOMb生成量和亚硝酸盐残留量影响较显著，对a*值影响显著，AC、BC影响均不显著。

2.4 响应面图分析

pH和反应温度的交互作用对a*值、NOMb生成量和亚硝酸盐残留量影响的响应面见图5。

由图5可知，随着反应温度的升高，a*值、NOMb生成量、亚硝酸盐残留量呈现先升高后下降的趋势。而随着pH的升高，a*值和NOMb生成量均呈现升高趋势，亚硝酸盐残留量呈现下降趋势。响应面坡度较陡，说明反应温度和pH之间交互作用显著，这与方差分析结果一致。

利用Design Expert 8.0.6软件对响应面优化试验结果进行回归方程拟合，得到二阶回归方程分别如下：

a*值=12.05+0.35A+3.51B+0.33C-0.75AB+0.34AC－0.12BC－2.12A2－0.47B2－0.72C2。

NOMb生成量=48.30+1.82A+14.27B－0.18C－3.09AB+0.16AC+0.27BC－7.11A2－2.26B2－1.23C2。

亚硝酸盐残留量=0.23－4.000E－003A－7.625E－003B+1.250E－004C+3.750E－003AB+1.250E－003AC+1.000E－003BC+4.500E－003A2－2.750E－003B2+1.750E－003C2。

当NOMb生成量和a*值最大时，模型的最佳优化工艺为：反应pH为6.5，反应温度为50 ℃，D-异抗坏血酸钠的添加量为0.07%，此时的NOMb生成量、a*值和亚硝酸盐残留量分别为59.836 g/100 g，14.99和0.219 mg。

2.5 验证试验

将优化出来的反应条件应用到模型中进行验证，设定反应pH为6.5，反应温度为50 ℃，D-异抗坏血酸钠添加量为0.07%，进行3次平行试验，实测a*值、NOMb生成量和亚硝酸盐残留量分别为14.92，59.705 g/100 g和0.204 mg，分别达到预测值的99.5%、99.7%、93.15%。说明该模型可以较好地解释pH、反应温度、D-异抗坏血酸钠添加量和a*值、NOMb生成量、亚硝酸盐残留量之间的关系。

3 结论

在Lactate-NAD-LDH模型下，反应温度和pH值对NOMb生成量、a*值和亚硝酸盐残留量的影响显著；D-异抗坏血酸钠添加量对NOMb生成量的影响显著，对a*值和亚硝酸盐残留量的影响不显著；反应温度和pH值对NOMb生成量、a*值和亚硝酸盐残留量有显著交互作用。a*值和亚硝基肌红蛋白生成量最大的反应条件为反应温度为50 ℃、pH为6.5、D-异抗坏血酸钠添加量0.07%，此时的a*值为14.92，NOMb生成量為59.705 g/100 g，10 mg肌红蛋白在此条件下所消耗的亚硝酸盐的量为0.204 mg。该结果可为肉制品加工时降低亚硝酸盐添加量提供一定的理论依据。

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