高酸度酒精醋发酵菌种和营养盐研究进展

宋来生 郭蕾 孙浩 洪厚胜 郭会明

摘要：利用醋酸菌转化食用酒精是生产高酸度醋的主要方法。目前，我国生产的高酸度酒精醋同国际领先水平还有差距。缩小差距、生产出酸度与质量更高的酒精醋是国内行业研究的热题。酒精醋生产过程中使用的醋酸菌与营养盐是影响发酵的重要因素。文章通过对高产酸醋酸菌的选育和酒精醋营养盐的研究进行了综述，为高酸度酒精醋的工业发展提供了一定的参考依据。

关键词：高酸度醋；酒精醋；醋酸菌；营养盐

中图分类号：TS264.22      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）05-0198-04

Abstract： Using acetic acid bacteria to convert edible alcohol is the main method to produce high-acidity vinegar. At present， there is still a gap between the high-acidity vinegar produced in China and the international leading level. Narrowing the gap and producing alcoholic vinegar with higher acidity and quality is a hot topic in domestic industry.Acetic acid bacteria and nutritive salt used in the production of alcoholic vinegar are important factors affecting fermentation. In this paper， the breeding of high acid-producing acetic acid bacteria and the research on alcoholic vinegar nutritive salt are reviewed， which has provided some references for the industrial development of high-acidity alcoholic vinegar.

Key words： high-acidity vinegar; alcoholic vinegar; acetic acid bacteria; nutritive salt

收稿日期：2022-11-27

基金項目：国家高技术研究发展计划项目（2012AA021201）

作者简介：宋来生（1999-），男，硕士，研究方向：食品发酵技术。

*通信作者：郭会明（1967-），男，副教授，硕士，研究方向：生化反应工程。

古语有云“开门七件事，柴米油盐酱醋茶”，由此可知在人们日常生活中，食醋具有十分重要的作用[1]。食醋不仅是餐桌上的酸性调味品，还能开胃消食，消毒杀菌，促进人体新陈代谢，消除疲劳，抑制血糖、血脂、血压升高，预防动脉硬化，提高机体免疫力，同时还有延缓衰老，抑制脂肪积累等功能[2-4]。而高浓度的醋因其储存运输方便、杀菌能力强等特点，在食品加工业、医药业、美容和家庭保洁业等方面有着广泛的应用[5]。

高酸度醋主要有酒精醋与蒸馏醋。由于液态发酵设备的不断改进以及国家颁布代粮发酵政策，酒精醋将成为我国食醋工业的主要支柱。因此，用食用酒精代替粮食发酵成醋是目前食醋行业研究的一大热点[6]。涂志英等[7]报道了芥末、番茄酱和沙司等食品需要消耗大量的酒精醋。而目前我国番茄酱的消费仍呈上升趋势，这也增加了酒精醋的需求量。酒精醋采用液态深层发酵直接转化95%食用酒精为醋酸，时间、人力、成本都呈大幅下降趋势，且极易推广[8]，这些都将给酒精醋的发展带来机遇。但生产高浓度的酒精醋，我国同德国、日本等国家还有较大差距。酒精醋发酵过程中所用的菌种和营养盐，都会对最终产品品质产生一定影响。本文将对高酸度酒精醋发酵的菌种和营养盐的相关研究进行综述，为高酸度酒精醋的生产提供研究思路。

1 高产酸醋酸菌选育

醋酸菌是食醋酿造中的主要微生物，虽然它的比生长速率比较依赖乙醇的浓度，但高浓度的乙醇或醋酸会严重影响发酵过程中的醋酸菌。因此，选育出具有较强乙醇氧化能力、耐受性较好的菌种，可以提高产酸量，对高酸度酒精醋的工业化生产具有重要的意义。目前对菌种的选育主要有3种方法：自然选育、诱变育种和基因工程技术[9]。

1.1 自然选育

自然选育是指对微生物群体不经过处理而直接进行分离筛选的方法，又称单菌落分离。对醋酸菌的自然选育是从醋醅中采集醋样，用生理盐水稀释成不同浓度的发酵液，在含有碳酸钙或溴甲酚紫的培养基上进行培养，选取菌落形态较好的单菌落进行纯化培养，直至得到大小形态一致的菌落，并斜面保藏，对斜面保藏的菌种进行产酸定性及定量分析，得到高产酸的纯化醋酸菌种。

杨杰等[10]从广西民间醋醅中初步筛选出5株产酸醋酸菌，经过产酸分析，乙醇耐受、乙酸耐受及温度耐受实验，发现KDA-2产酸能力最强，且耐受性最好。在30 ℃时产酸量最大，为39.9 g/L，在36 ℃、9%乙醇条件下仍然可以较好地产酸。冯荆舒等[11]使用含溴甲酚紫的培养基从镇江香醋醋醅中初步筛选出41株醋酸菌，经过产酸定量实验发现H3的产酸量始终高于其他菌株，为44.16 g/L，能够耐受9%的乙醇和3%的乙酸。

经过自然选育得到的菌株，虽然方式简单，但菌株突变率很低，无法获得新的醋酸菌，筛选出的菌种性状往往不如工业上使用的纯种AS1.41和沪酿1.01。

1.2 诱变育种

诱变育种在醋酸菌的工业化育种中发挥着重要作用，它是通过使用各种物理或化学诱变剂来增加突变率，然后产生阳性突变菌株，进而筛选出耐受性好、产酸高的菌株的一种方法。

野生型工业醋酸菌经过酸性胁迫和紫外线诱变处理，得到的突变体进化出更高的耐性和产酸能力。突变体可耐受60 g/L的初始酸度，比野生型增加了33%。在摇瓶中发酵时，最大乙酸积累量达到103.81 g/L，同时突变株的ADH和ALDH活性比野生型高20%～40%[12]。李文等[13]在腐烂的猕猴桃中筛选出一株产酸量高且耐醇耐温较好的菌株，利用能量为10 keV，剂量为70×2.6×1013 ions/cm2的N+进行诱变试验，从变异菌株后代中筛选出一株产酸高、能耐40 ℃高温、耐高醇12%且遗传稳定的菌种。产酸量较传统酿造提高了30.54%，醇酸转化率提高了18.81%。邓洪钧等[14]从山西老陈醋醋醅中筛选出一株耐受40 ℃的巴氏醋杆菌，利用常温等离子体对菌株进行诱变处理，选育出较高产酸的菌株进行发酵试验，发现诱变后的菌株比诱变前发酵效率提高了10%。Wei等[15]使用盐酸羟胺和紫外线诱变产生两个突变群体。然后，通过融合两个群体的原生质体，对两个突变群体的基因组进行重组，并在乙醇浓度较高的培养基上进行培养。获得了一株能在含13%乙醇的液体培养基中生长、产酸能力是野生型菌株2倍的突变醋酸菌。

使用诱变育种对醋酸菌进行选育，突变频率较高，可以获得新的菌株，但无法控制突变方向，耗时较长，产生负突变的菌株占有较大的比例。

1.3 基因工程技术

基因工程对于醋酸菌的改良是极具潜力的一种技术，它可以通过对某一基因片段的扩增或敲除来精确修饰醋酸菌的基因，从而实现有目的的菌种改良，得到产酸高、耐性优良的醋酸菌[16]。一般来说，对醋酸菌的基因改造可分为以下几个方面：优化代谢途径、调节转录因子和提高耐受性[17]。

1.3.1 优化代谢途径

通过优化代谢途径，可以提高目标产物的产量，并减轻底物或产物的反馈抑制。随着醋酸持续发酵，乙酸引起的酸胁迫会破坏细胞膜，抑制多种酶和转运系统活性，大大降低醋酸菌的生产效率。依赖于吡咯喹啉醌（PQQ）的膜结合乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）是醋酸菌将乙醇转化为醋酸的两种关键酶，而且在耐酸醋酸菌中ADH的含量明显高于其他菌株[18]。因此，通过过度表达ADH、ALDH或PQQ，优化醋酸的代谢途径，可以有效地提高醇酸转化率，增加醋酸产量。宋山等[19]对醋酸菌的乙醇脱氢酶通过PCR技术进行基因扩增，使得乙醇脱氢酶得以过表达。结果表明，在相同条件下，改良后的醋酸菌在醇酸转化率和乙醇耐受程度上都高于原始菌。Beppu[20]对一株耐酸醋酸菌的ALDH基因进行扩增，发酵结果表明醋酸发酵速率由1.8 g/（L·h）提高至4.0 g/（L·h），产生醋酸最大浓度为96.9 g/L，与对照相比高出了1.4倍左右。Gao等[21]对巴氏醋杆菌中乙醇氧化途径和PQQ合成途径中两个模块的基因进行各种组合过度表达，来平衡脱氢酶与辅助因子的关系。发现同时过表达ADH与pqqABCDE的巴氏醋杆菌相较其他过表达菌株在含有3%初始乙酸的培养基中生长速率最高，在半连续发酵过程中启动时间最短，平均生产率最高。

由于醋酸菌耐酸机制中对醋酸的同化作用，当A.aceti在含有1%乙酸的培养基中培养时，三羧酸循环（TCA）中乌头酸酶会显著上调。于是Nakano等[22]对该现象进行了深入研究，通过对乌头酸酶的基因进行扩增，使乌头酸酶的活性增强，优化三羧酸循环途径，进而生产更高浓度的醋酸，并缩短生长滞后时间。Yang等[23]首次发现乙酸浓度增加时，2-甲基柠檬酸循环相关的操纵子基因明显上调，推测2-甲基柠檬酸循环可能对醋酸菌的耐酸性具有潜在的贡献。虽然没有通过修饰基因来证实这一结论，但可以为醋酸菌的基因工程育种提供一定经验。

1.3.2 调节转录因子

当醋酸菌所处的外界环境发生变化时，可以通过转录调节网络对环境变化作出反应，并优化其代谢以适应新的条件。近年来，许多研究人员试图通过工程转录调控蛋白直接或间接地操纵转录调控网络，来增强醋酸菌的生产效率及耐受能力[24]。在G. intermedius中发现了一种基于N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）的群体感应系统GinI/GinR。其中GinI用来指导3种具有不同酰基链的AHL的合成，而GinR作为转录调节器，通过与AHL结合参与抑制乙酸和葡萄糖酸的产生。Iida等[25]为了提高G. intermedius在含乙醇的培养基中的生长速度，对GinI和GinR进行了破坏，破坏后的菌株的乙酸和葡萄糖酸产量分别比原始菌株提高了42%和16%，而且具有更强的消泡能力。

1.3.3 提高耐受性

在醋酸发酵过程中，醋酸菌不可避免地暴露在各种应激源中，比如高温、乙醇和醋酸，这些因素会抑制醋酸菌的生长和代谢。但当醋酸菌受到刺激时，一些热休克蛋白和核苷酸修复蛋白会被反复上调，以此提高醋酸菌的耐受性，提升醋酸产量。因此，可以通过对应激蛋白基因的修饰，对醋酸菌耐温，耐酸有关的因素进行定向的构建和表达，优化醋酸菌的耐受性，得到抗逆性状优良的菌种。

DnaK、DnaJ和GrpE是醋酸菌耐热机制中研究较多的热休克蛋白，三者相互作用，一起调节分子伴侣的活性，当醋酸菌受到外部环境变化刺激时会做出应激反应。Ishikawa等[26]对不同应激源下巴氏醋杆菌GrpE、DnaK和DnaJ 3个基因的相对表达水平进行了测定，在温度从30 ℃变为42 ℃过程中，3种基因的mRNA水平均有提高。在4%乙醇刺激下，也得到了相同结论。然后对不同应激条件下3种基因过度表达，来观察对醋酸菌生长的影响，结果显示，当GrpE与DnaK-DnaJ共同过度表达时，即使在42 ℃高温环境下，醋酸菌的生长行为与最适条件下几乎相同。Zheng等[27]发现乙酸能上调核酸修复蛋白UvrA的表达，于是构建了UvrA敲除菌株和过表达菌株让其在含有乙酸的培养基中培养，过度表达UvrA菌株的生长量明显高于敲除菌株，即使在6%乙酸条件下，前者的存活率也高于后者。同时，过度表达UvrA的巴氏醋桿菌较野生型菌的醋酸转化率提高了21.7%。

醋酸菌细胞膜上存在一种由乙酸诱导的蛋白质AatA，它是一种ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白，可以利用ATP水解的能量使细胞内的有毒化合物排出，使细胞内乙酸浓度处于较低水平，避免大量乙酸引起的反馈抑制使细胞凋亡。 Nakano等[28]通过对醋酸菌中AatA基因的过表达，增强了醋酸菌的耐酸性，使得过表达后的醋酸菌在90 g/L醋酸浓度下的产酸速率与40 g/L条件下几乎相同，最终产酸量达到117 g/L。

相较于自然选育与诱变育种，基因工程技术具有高效、快捷的优越性，不仅可以精确修饰微生物靶基因，还可以将分离出的基因导入到另一菌体中，从而准确有效地构建出性状更为优良的醋酸工程菌，对推动高酸度酒精醋的工业发展有重要意义。

2 高酸度酒精醋发酵营养盐

酒精醋发酵液中除了乙醇外，没有任何其他物质。而乙醇不能够满足醋酸菌的生长代谢，所以在酒精醋发酵过程中需要添加其他营养物质来支持醋酸菌的生理活动，如碳源、氮源、生长因子等[29]。醋酸菌的发酵效果与醋的品质皆受到营养盐的影响，因此，想要生产高酸度的酒精醋就要使用能够提升醋酸菌发酵效率的营养盐。当前食醋行业一般使用德国Frings营养盐，价格昂贵，经济成本较高。因此，国内也对研制出一种既能使醇酸转化率和产酸速率提高，又能减少生产成本的营养盐做了许多研究。

無机元素作为构成生物体的重要组成成分，有着维持酸碱平衡与渗透压的作用。因此，以葡萄糖为碳源，酵母粉为氮源，添加无机离子的营养盐成为许多工作者的研究方向。张锦林等[30]发明了一种醋酸菌营养素用于液态食醋发酵酸化过程，其配方为葡萄糖76.3%、水解酵母粉15.2%、磷酸铵4.0%、硫酸铵2.0%、醋酸铵1.25%、柠檬酸铵1.25%。杨海麟等[31]优化的营养盐产酸速率达到2 g/（L·h），相对当时的国内生产水平提高了33%，其组成为44.8%葡萄糖、26.5%酵母粉、15.5%柠檬酸铵、3.7% NaH2PO4、4.2% KH2PO4、5.3% MgSO4。张晓辉等[32]则采用自制营养盐与Frings营养盐以8∶2的比例混合进行发酵，发酵周期相当的同时节约了13.7%的成本。除此之外，也可以通过添加某些氨基酸或醋酸菌代谢过程中相关因子的前体来配制营养盐，实现高效率发酵。

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，在细胞生长代谢中起着重要的作用，而且培养基中游离的氨基酸是醋酸菌的良好氮源。Yin等[33]在葡萄糖-蛋白胨培养基中分别添加了16种氨基酸，发现Asp、Glu能显著促进细胞生长，生物量分别比对照组高1.04倍和0.51倍，产酸量分别提高了1.45倍和0.6倍。通过蛋白组学分析，添加Asp和Glu后可以通过促进磷酸戊糖和NADPH的生成来提高巴氏杆菌的抗酸应激能力，从而在整个磷酸戊糖途径（PPP）中合成核酸、脂肪酸和谷胱甘肽（GSH），加强氨基酸脱氨作用，提高细胞内氨浓度，维持细胞内pH的稳定性，促进核酸合成和修复酸胁迫损伤引起的受损DNA，提高醋酸菌的耐受性，使产酸量增加。

添加代谢过程中相关因子的前体，醋酸菌不需要通过自身合成便可直接利用前体物质，可以减轻在代谢过程中的压力，发酵效率也会因此而提升。血红素广泛存在于乙醇呼吸系统的酶中，并通过氧化还原电位变化在电子传递中发挥主要作用，而亚铁离子是构成血红素的物质之一。辅酶Q是醋酸杆菌乙醇呼吸链中唯一可自由穿梭的电子传递载体，β-羟基苯甲酸是辅酶Q的前体之一。因此，可以向培养基中加入这些前体物质来增强乙醇呼吸链，提高醋酸发酵效率。Qi等[34]在葡萄糖-酵母膏培养基中加入FeSO4与β-羟基苯甲酸，缩短了发酵时间，产酸速率较原始水平提升了20%，并且ADH、ALDH活性与辅酶Q9的含量分别提高了31%、33%和102%。Yin等[35]认为亚铁离子和葛根花提取物对ADH和ALDH的代谢有激活促进作用，于是向葡萄糖-酵母膏培养基中分别加入FeSO4与葛根花提取物，产酸量分别提升了17.3%和13.2%。以上工作虽然没有研究营养盐的具体配方，但表明了向发酵液中加入醋酸菌代谢过程中相关因子前体或相关酶的促进剂，可以改善发酵效率，提高醋酸产量，为后续营养盐的研发提供了经验。

3 结论与展望

醋酸菌是一种催化乙醇转变为乙酸的生物催化剂，想要提高发酵效率就要对催化剂进行优化，即对产酸量高、耐受性好的醋酸菌进行筛选育种。目前主要有3种技术：自然选育、诱变育种和基因工程技术。其中，基因工程技术是培育优良醋酸菌比较好的方法，具有较强的针对性，可以对醋酸菌代谢过程中某些相关基因进行定向修饰，对高酸度酒精醋的发展具有重要意义。随着基因工程技术的发展，利用基因分离、克隆和重组等技术，对醋酸菌各功能基因进行人为构建，得到在常温条件下产酸更高的菌株将成为可能。

营养盐是影响高酸度酒精醋发酵的一个重要因素，目前国内酒精醋行业一般使用的是德国Frings营养盐，但是生产成本较高。国内也对酒精醋营养盐做了许多研究，虽然成本具有一定优势，但发酵效果与Frings营养盐还有差距。因此，基于醋酸菌生长代谢的营养需求研发出一种达到国际水平且能降低生产成本的营养盐，对我国高酸度酒精醋工业发展具有重要意义。

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