“多光子吸收四苯乙烯三吡啶Fe(II)配合物的合成及ROS探索”实验教学实施结果与探讨

张琼　汪琪琦　王仁昊　肖文岩　蒋艺铭　李胜利

摘 要：主要介绍安徽大学专门为国家级大学生创新创业训练计划设计的“多光子吸收四苯乙烯三吡啶Fe（II）配合物的合成及ROS探索”实验教学实施结果与探讨。以四苯乙烯三联吡啶Fe（II）配合物的合成为基础，围绕创新和创业两大目标，实现配合物多光子吸收性质创新，探索配合物的ROS性能，评估化学动力学治疗效果。全文以实验為依据，对结果进行分析、反思、判断。结合实验结果，探索配合物在癌症治疗方面的实际应用，使其具有创业潜力。

关键词：无机及分析化学；铁配合物；多光子吸收；ROS检测

中图分类号：G642.1；O614.7  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2023）02-0098-04

在我国当前的教学改革中，如何把创新发展的思想融入大学的日常教学，培养具有创新精神和创新能力的大学生是核心问题。综合化学实验可以把基础化学与基础实验技能有机地结合起来，使学科的研究前沿与其融为一体，能充分体现学科交叉发展，培养学生的创造性[1，2]。

在无机及分析化学教学中，d区元素相关内容通常在学期中旬之后讲解，内容多，学时少[3]。在本科阶段无机及分析化学实验课程中，有关d区铁锰配合物的实验更是少之又少。在学生完成了无机及分析化学理论及实验课程的学习后，我们专门安排了大学生创新创业训练计划，即组织和引导学生从配合物制备入手，围绕配合物的合成及性质，以配合物详细的制备流程和光谱性质为基础，实验结果为依据，巩固学生的理论知识。结合长期积累的实验与教学工作经验，专门为国家级大学生创新创业训练计划量身定制“多光子吸收四苯乙烯α三联吡啶Fe（II）配合物的合成及ROS探索”实验，系统研究构效关系，探索配合物在生物医药方面的实际应用，使其具有创业潜力。

三联吡啶（tpy）是N^N^N型三齿配体，在配位化学领域中占据重要的地位[4，5]。三联吡啶和其衍生物具有三个N-配位点，三联吡啶衍生物及其组装的配合物材料可以按照用途的要求，通过制备新配体和选择合适的金属中心离子，以此调整控制配合物的功能。因此，在催化、光电功能材料、生物传感、医疗诊断等领域有着广泛的应用价值[6，7]。

该创新创业训练计划以多光子吸收过渡金属配合物的生物成像应用为导向，设计合成多光子吸收有机配体，通过引入四苯乙烯基团来增强配体的生物相容性，由于四苯乙烯是经典的聚集诱导发光特征配体[8]，配合物大共轭体系可促进产生非线性光学活性；同时铁配合物中Fe2+可与H2O2发生芬顿反应，产生羟基自由基（·OH），这也使得其具有化学动力学治疗的潜力。

1 实验部分

1.1 实验目的

通过科研前沿成果，了解配合物基本概念及铁系配合物最新研究进展，掌握铁系配合物的合成方法及光物理性质，学会使用大型仪器进行光物理性质测试及分析测试数据。

1.2 试剂、仪器

药品和试剂：配体FA，六氟磷酸钾，无水乙腈，二氯化铁，溶剂均为分析纯，并按照标准方法进行干燥和纯化后使用。

仪器：手持LED灯（美国GE公司）、傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet FT-IR NEXUS 870 spectrometer）、紫外可见分光光度计（UV-265）、质谱仪（Thermo Fisher Scientific LTQ-Orbitrap XL mass spectrometer）、全自动协调飞秒激光器（Ti：95蓝宝石，80MHz，140fs，Chameleon Ⅱ 680nm-900nm）。

1.3 双光子吸收截面

论文通过开孔Z-扫描对配合物FA-Fe-FA的双光子吸收性质进行探索，通过Z扫描测试可以直接得到入射功率和出射功率，并进一步得到测试样品的透过率T（z），基于空间和时间高斯脉冲，归一化的能量透射率T（z）由以下方程得到：

λ是入射光波长，ω0为入射光束腰的半径，α0为样品在工作激光下的线性吸收系数，Z为样品距离焦点的位移，是曲线的横坐标，I0为焦点处的入射光强度，Leff是有效样品厚度，双光子吸收截面：

式中的h为普朗克常数，γ为入射光的频率，NA=6.02×1023为阿伏伽德罗常数，d为样品浓度。

通过此公式计算得出双光子吸收系数β以及双光子吸收截面σ的值。

1.4 合成与表征

FA的合成步骤：在250mL圆底烧瓶，依次加入3.6g（0.03mol）2-乙酰基吡啶，少量无水乙醇，以及2.8gKOH水溶液，常温搅拌15min，逐滴加入30mL氨水，回流3h，冷却后抽滤得到2.0g的黄色固体粉末，产率84%。ESI-MS：calculated： for [M+H]+;564.24，found：564.24

FA-Fe-FA合成路线如下：

配合物FA-Fe-FA的合成：将配体FA（0.563g，0.001mol）加入100mL圆底烧瓶中，再向圆底烧瓶中加入适量的无水乙腈（悬浮液）在80℃条件下逐滴滴加二氯化铁（0.08g，0.0005mol）的无水乙腈（10mL）溶液，充分反应2小时后，向其中加入过量的六氟磷酸钾，冷却至室温，过滤，干燥、得紫色固体0.48g，产率：82%。ESI-MS M/2： 591.42 calcd for： M/2： 591.42，found： 591.42 FT-IR（KBr，cm-1）： 3906（m），3857（m），3762（m），3654（m），3565（m），3050（m），2371（m），1660（m），1564（m），1392（s），1164（m），1075（m），1017（m），846（s），751（s），707（s），548（m）。

由于金属铁具有磁性，无法得出配合物完整的13C和1H谱。对于含磁性金属中心的配合物，通常采用质谱，红外来确定物质结构。例如质谱：通过ChemDraw模拟可得FA-Fe-FA的分子量为591.42 （M/2），ESI-MS的结果为591.42（M/2）与ChemDraw结果一致。

2 配合物的光物理性质研究

2.1 紫外-可见吸收光谱

如图3紫外-可见吸光光谱所示，配合物FA-Fe-FA具有两个比较明显的特征吸收峰，在300nm左右存在一个强吸收峰，在580nm存在一个弱吸收峰，300nm处的中等强度吸收峰为配体（FA）的π-π*跃迁。配合物FA-Fe-FA在580nm处的吸收峰归则因于LMCT[π*（FA）-dπ（Fe）]特征吸收峰。

2.2 配合物的双光子吸收性质

经过前面的教学，我们发现学生对“配合物的应用”章节极为感兴趣，故在实验教学最后，增加了配合物多光子吸收性质研究，通过引导学生查阅文献，以翻转课堂形式进行配合物实际应用趣味教学，调动学生的积极性参与到教学过程中。什么是双光子吸收？双光子吸收是指材料分子在强脉冲激光激发下同时吸收两个以上光子达到虚拟中间态（virtue state）的过程[9，10]。与单光子吸收相比，双光子吸收（2PA）激发光的波长近似等于单光子激发的两倍。而这种近红外波段的长波激发光具有穿透深度深、光稳定性好等优势[11-14]。

在进行配合物的双光子吸收性质教学时，需要介绍进行双光子吸收性质测试的实验方法，包括荧光对比法和Z-扫描法。荧光对比法通常针对具有荧光的分子，而不具有荧光性质的分子使用Z扫描方法来测试其双光子吸收性质[15-17]。

由图4及公式计算可知，配合物FA-Fe-FA在900nm激发波长下具有良好的双光子吸收信号，双光子吸收系数β为0.3496cm/GM；双光子吸收截面为4774.5GM，表明这一配合物具有优良的双光子吸收活性，可进一步应用于生物探索。

3 生物应用探索

大学生创新创业训练突出创新和创业两大目标，为了研究该实验所获得产物的应用价值，实现创业目标，我们将FA-Fe-FA应用于生物体系，研究配合物ROS能力，评估其是否存在进行肿瘤诊疗的潜力。在肿瘤细胞中，过氧化氢（H2O2）的浓度较高，而在铁配合物中的二价铁可与H2O2进行芬顿反应，生成羟基自由基（·OH），由此提高细胞内活性氧（ROS）的含量[18-20]。最终导致Ferroptosis（铁死亡），诱导癌细胞凋亡。

通过羟基自由基指示剂（对苯二甲酸）对羟基自由基（·OH）进行测定，向2mL（10-4mol/L）FA-Fe-FA溶液中加入20μL H2O2的溶液，经过5min的孵育，然后将1mL（10-3mol/L）对苯二甲酸添加到该溶液中，对425nm处的荧光发射峰（对苯二甲酸的特征发射峰）进行检测，如图5a所示，对苯二甲酸的特征发射峰荧光强度随着时间不断增强。如图5b，紧接着检测不同的量的H2O2的溶液中对苯二甲酸的荧光，可以看出H2O2的量越高，其荧光强度也越高。

以上测试结果表明FA-Fe-FA中的Fe2+与H2O2发生芬顿反应生成羟基自由基（·OH），增加了细胞内活性氧（ROS）的水平。

在體外测试的结果支持下，进行了细胞成像实验，进一步研究铁死亡的性能。如图6所示，利用FA-Fe-FA对HeLa细胞进行连续10分钟的孵育，在细胞膜周围出现FITC的荧光信号和PI信号。根据实验结果，在孵育10min左右时，细胞开始出现凋亡。孵育时间越长，羟基自由基产生的量越多，使细胞膜的完整性被损害。PI信号明显。孵育期为30min时，通过两种商染染色及细胞形态进行分析，HeLa细胞的凋亡率接近百分之百。综上而言，FA-Fe-FA有产生羟基自由基的能力，提升细胞内活性氧（ROS）的含量，最后引起铁死亡，在肿瘤诊断和治疗方面都有很大的潜力。

4 结论

结合最新学术进展，为国家级大学生创新创业训练计划设计了一个综合化学实验，以四苯乙烯三联吡啶为主配体，设计合成配合物FA-Fe-FA，发现FA-Fe-FA具有较大的双光子吸收截面。研究了铁配合物产生·OH能力，配合物中Fe2+可与H2O2进行芬顿反应，生成羟基自由基（·OH），提高细胞内活性氧（ROS）含量，促进癌细胞凋亡，达到化学动力学治疗效果。本实验体现了对无机化学及分析化学中涉及d区元素部分基础知识与实验操作的综合性要求，围绕创新与创业两大目标，实验步骤设计合理，实验结果明确，理论与实践相结合，使学生产生浓厚的学习兴趣，实验包含有大型仪器操作和数据分析等，提高了学生综合运用知识分析实际问题的能力，同时也为本科毕业设计奠定了基础。

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收稿日期：2022-10-07

通讯作者：李胜利（1968-），男，汉族，安徽巢湖人，博士，教授。研究方向：非线性光学材料。

基金项目：国家自然科学基金（21871003）；安徽省自然科学基金（2008085QB52）；安徽大学质量工程（2022）项目