间充质干细胞外囊泡参与肝脏缺血再灌注的研究进展

张佳阳　李红男　刘润生　曲明海　邢雪琨

【摘要】  肝脏缺血再灌注会引起细胞损伤和器官功能障碍。间充质干细胞外囊泡作为细胞间物质转运和信息传递的载体，在肝脏抗氧化应激、促进组织修复等方面发挥重要作用。不同来源的间充质干细胞外囊泡转运效果不同，已有的细胞和动物实验证明间充质干细胞外囊泡有助于改善肝脏缺血再灌注损伤。本文从间充质干细胞外囊泡对肝脏缺血再灌注机制的研究展开综述，探讨其发挥的重要作用。

【关键词】  肝脏缺血再灌注；间充质干细胞；细胞外囊泡

中图分类号  R329.2    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2023）01--04

Research progress of extracellular vesicles of mesenchymal stem cells involved in hepatic ischemia-reperfusion Zhang Jiayang， Li Hongnan， Liu Runsheng， Qu Minghai， Xing Xuekun.School of Public Health， Guilin Medical University，Guilin 541199， China

【Abstract】  Liver ischemia-reperfusion can cause cell damage and organ dysfunction. Study found that mesenchymal stem cells outside the vesicles as a material transfer and information transmission between the cells of the carrier， to promote tissue repair in liver oxidative stress resistance， play a role in such aspects， ectomesenchymal stem cells from different sources outside the vesicle transport effect is different， the existing cell and animal experiments proved vesicle helps to improve liver ischemia-reperfusion injury. It will bring a new direction to the experiments of exocyst administration of mesenchymal stem cells after liver transplantation. This article reviews the mechanism of hepatic ischemia-reperfusion induced by extracellular vesicles of mesenchymal stem cells and discusses its important role.

【Key words】   Ischemia reperfusion; Mesenchymal stem cells; Extracellular vesicle

肝臟缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）指肝脏在血流阻断（缺血）基础上恢复血流灌注所引起的细胞损伤和器官功能障碍，失血性休克、肝脏切除术和肝移植术等均可诱发肝脏IRI，其也是肝脏手术中导致肝损伤的主要原因之一[1-3]。随着外科手术技术、免疫抑制技术和围手术期护理技术的提高，肝移植术已发展成为各种终末期肝病的有效治疗方法之一。目前，肝移植术已经在全球80多个国家开展，尽管接受肝移植术治疗的患者术后1年生存率超过80%[4]，但IRI仍是影响肝移植患者预后的主要原因之一[5]。IRI诱导的肝细胞损伤与肝移植术后早期移植物功能不良相关，甚至能诱导移植肝原发性无功能的发生[5]。肝脏IRI可导致细胞因子、趋化因子释放，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，除引起肝脏本身损伤外，还可导致远端器官如肾脏、肾上腺、肺脏、胰腺、肠道的损伤[6]。

1 间充质干细胞及间充质干细胞外囊泡的作用及区别

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作为高度分化的多功能细胞，其成纤维细胞的异质性能进入各种中胚层体系，主要来源包括骨髓、脐带、肌肉和脂肪组织等[7-9]。MSCs被国际干细胞研究学会定义为塑料黏附细胞，在标准条件下具有附着的成纤维细胞样形态，在标准体外分化条件下可分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。MSCs不表达人类白细胞抗原Ⅱ类分子，使其能够逃避异基因免疫问答，这一“免疫特权”使MSCs非常适合自体移植和同种异体移植[10-11]。

不同于MSCs具有多向分化能力和发生肿瘤的潜能，MSCs外囊泡（extracellular vesicles from MSCs，MSCs-EV）可降低致癌风险。基于当前的生物起源，细胞外囊泡可以大致分为两类：外泌体和微泡。外泌体直径一般为50～150nm，微泡直径为50～500nm（最大至1μm）[12]。考虑到MSCs的异质性，不同来源MSCs的免疫调节和血管生成作用不同[13]。目前在临床试验中使用MSCs仍存在争议，且尚不清楚MSCs治疗肝病的最佳剂量。有研究表明，大剂量MSCs输注后可引起肺栓塞，而MSCs-EV较小且比MSCs更稳定，在储存和运输过程中也更容易对质量和数量进行控制[14]。

2  MSCs-EV抗炎症反应

骨髓MSCs-EV可以减少组织损伤，MSCs-EV在体内和体外均能降低炎症介质的表达，通过释放内源性危险信号来调节先天免疫系统快速启动无菌炎症反应对抗可能导致的肝脏IRI。胱天蛋白酶1（caspase-1）和炎症小体依赖性通路可能参与肝脏IRI，NOD样受体（NOD-like receptors，NLR）是一类重要的细胞液模式识别受体，它负责激活一些内部分子，例如识别细胞内危险相关分子模式的响应病原体，导致NOD样受体家族含Pyrin结构域蛋白3（NOD-like receptor family Pyrin domain-containing protein，NLRP）、NLRP4等炎症小体的形成，白细胞介素（interleukin，IL）-1β前体和IL-18作为炎症和细胞死亡反应的重要介质，受caspase-1激活后形成，导致细胞凋亡[15-17]。有观察结果表明[18-19]，MSCs-EV的作用不是通过直接影响促炎性NLR表达实现的，而是通过NLRP12减轻炎症，NLRP12是一种通过减弱非典型核因子κB信号在体外免疫系统和其他环境下炎症活动的负性调节因子。它在炎症应激时，可以起到肝脏保护作用，即使MSCs-EV增加了多个NLR的表达，但IL-1β的表达在MSCs-EV参与的IRI过程中降低，靶向NLRP12介导的抗炎反应来调节肝脏IRI作为一种治疗策略值得进一步探讨。

在实验诱导的氧化应激中，MSCs-EV可在减轻与组织损伤相关炎症反应中发挥作用，MSCs-EV可以抑制肝细胞中NF-κB活性，如IL-6和IL-1β是由NF-κB激活转录调节的细胞因子的表达而生成[20]。MSCs-EV可增加小鼠正常肝细胞（AML12）体外释放CXCL1。CXCL1 mRNA在肝脏IRI过程中表达增加，并由MSCs-EV增强进一步表达。此外，CXCL1可直接增加肝细胞增殖[21-22]。因此，CXCL1可能参与损伤后的组织修复反应。虽然还没有确凿的证据，但肝脏CXCL1表达增加可能有助于募集释放NLRP12的细胞。减少肝脏IRI可以增加边缘肝脏如来自扩展标准供体的使用，并增加供者器官库的可用性，从而降低晚期肝病的死亡率，以上研究支持来源于MSCs的EVs用于治疗减轻肝脏手术或肝移植术后肝脏IRI[23-24]。

3  不同来源MSCs-EV的作用机制

3.1  脐带MSCs

Zheng等[25]表明脐带MSCs外囊泡通过分泌一种新型聚集自噬受体——含TCP1伴侣蛋白亚基2发挥免疫调节功能，抑制CD4+ T细胞上CD154的表达从而保护肝脏。此外，这种有益作用可能主要与EVs的含TCP1伴侣蛋白亚基2影响钙通道，下调细胞内钙浓度，抑制活化T细胞核因子1向细胞核转移有关。CD154是一种短暂性蛋白，在CD4+ T細胞中表达，是IRI中不可或缺的肝损伤和肝炎症因子；活化T细胞核因子1是调控T细胞分化、活化、耗竭和自我耐受的关键转录因子[26-29]。

使用抗体CD40或敲除CD154在体内表达有助于抑制炎症反应[27]。有研究发现[25]，在炎症刺激6 h后CD4+ T细胞表达达到高峰，CD154表达也明显增加，从而激活CD4+ T细胞并与其同源受体CD40相互作用刺激适应性和先天免疫系统，用抗体CD40或敲除CD154治疗的目的是在早期抑制CD154表达，阻断炎症反应的中间过程以改善肝脏IRI。

肝细胞敲除Yes-相关蛋白可导致严重的肝损伤，Iverson等[30]通过构建非酒精性脂肪肝小鼠模型Albumin-Cre小鼠与Yapflox小鼠，观察这些小鼠的血清谷丙转氨酶升高水平和病理肝改变，提示Yes-相关蛋白不表达在聚集性肝脏IRI中起关键作用。有研究发现一种新的Yes-相关蛋白激活的机制是通过CD47/CD172a通路激活影响肝脏外囊泡的释放，CD47通过靶向CD172a富集外囊泡可能是治疗肝脏IRI的一种新策略[31]。

3.2  肝脏MSCs

人肝干细胞来源外囊泡在体内可保护肝脏免受IRI的影响，Calleri等[32]验证了其在缺血持续90min的小鼠肝脏IRI中存活，并使用人肝干细胞来源外囊泡成功促进了70%肝切除小鼠模型的肝再生。实验中分别使用高低两种剂量的外囊泡，高剂量组与对照组谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶比较无差异，存活时间无明显差异，提示高剂量外囊泡不能保护肝脏免受IRI的影响，低剂量组结果表明在人肝干细胞来源外囊泡处理后，谷丙转氨酶释放明显增加，对缺血损伤的肝细胞有较强的保护作用[32]。有证据显示，人肝干细胞来源外囊泡在80℃下保存6个月才失去生物活性，表明它们比干细胞的储存时间更长[33]。

3.3  骨髓MSCs

在肝缺血再灌注发生时，高迁移率族蛋白B1释放到细胞外空间，通过Toll样受体释放信号和损伤相关细胞因子来激活促炎症反应[34]，在啮齿类动物模型中使用高迁移率族蛋白B1中和抗体，通过下调高迁移率族蛋白B1 siRNA表达水平，有效保护肝脏缺血再灌注损伤组织[35]。IL-1可诱导肝脏中细胞间黏附分子-1表达从而影响中性粒细胞的转运[35-36]，而抗体抗细胞间黏附分子-1可预防中性粒细胞外渗，明显减轻肝损伤[37]。有研究对比分析了骨髓来源MSCs和MSCs衍生外囊泡与人类成年真皮成纤维细胞及衍生外囊泡在小鼠肝IRI后期模型[38-39]，发现与用成纤维细胞及衍生外囊泡处理小鼠相比，在此前先静脉注射MSCs和MSCs衍生的外囊泡肝缺血导致的肝损伤显著减轻。综合数据显示，成纤维细胞或成纤维细胞衍生的外囊泡在IRI后不能防止肝损伤，而MSCs和MSCs衍生外囊泡有望成为未来IRI的治疗方法。

4  小结

MSCs-EV作為载体，在转运物质方面发挥了重要作用，不同来源的MSCs-EV转运效果也不同。以上从基础实验机制方面阐述了不同来源的MSCs-EV在肝脏缺血再灌注中的作用，使用MSCs-EV促进肝组织修复在许多不同的模型中得到验证，为其临床修复肝损伤带来新的可能。由于大多数研究采用细胞实验和小鼠模型来进行，尚处于研究阶段，所涉及的一些通路和作用机制还需进一步验证。未来MSCs-EV将会给肝脏IRI带来新的希望，特别是应用于临床研究，寻求其中特异性治疗靶点。

5  参考文献

[1] Montalvo-Jave EE，Piña E，Montalvo-Arenas C，et al.Role of ischemic preconditioning in liver surgery and hepatic transplantation[J].J Gastrointest Surg，2009，13（11）：2074-2083.

[2] Fondevila C，Busuttil RW，Kupiec-Weglinski JW.Hepatic ischemia/reperfusion injury-a fresh look[J].Exp Mol Pathol，2003，74（2）： 86-93.

[3] de Rougemont O，Dutkowski P，Clavien PA.Biological modulation of liver ischemia-reperfusion injury[J].Curr Opin Organ Transplant，2010，15（2）： 183-189.

[4] Zarrinpar A，Busuttil RW.Liver transplantation：past， present and future[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2013，10（7）：434-440.

[5] Hwang W，Lee J.Pathophysiologic Implications of Cytokines Secretion duringLiver Transplantation Surgery[J].Int J Med Sci，2018，15（14）： 1737-1745.

[6] Nastos C，Kalimeris K，Papoutsidakis N，et al.Global consequences of liver ischemia/reperfusion injury[J].Oxid Med Cell Longev，2014，2014： 906965.

[7] Uccelli A，Moretta L，Pistoia V.Mesenchymal stemcells in health and disease[J].Nat Rev Immunol，2008，8（9）：726-736.

[8] Giuliani M，Oudrhiri N，Noman ZM，et al.Human mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells down-regulate NK-cell cytolytic machinery[J].Blood，2011，118（12）：3254-3262.

[9] Arslan F，Lai RC，Smeets MB，et al.Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels， decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Stem Cell Res，2013，10（3）：301-312.

[10] Erpicum P，Detry O，Weekers L，et al.Mesenchymal stromal cell therapy in conditions of renal ischaemia/reperfusion[J].Nephrol Dial Transplant，2014，29（8）：1487-1493.

[11] Puglisi MA，Tesori V，Lattanzi W，et al.Therapeutic implications of mesenchymal stem cells in liver injury[J].J Biomed Biotechnol，2011，2011：860578.

[12] van Niel G，D'Angelo G，Raposo G.Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2018，19（4）：213-228.

[13] Boregowda SV，Krishnappa V，Haga CL，et al.A Clinical Indications Prediction Scale Based on TWIST1 for Human Mesenchymal Stem Cells[J].EBioMedicine，2015，4：62-73.

[14] Yao J，Zheng J，Cai J，et al.Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response[J].FASEB J，2019，33（2）：1695-1710.

[15] Nauta AJ，Kruisselbrink AB，Lurvink E，et al.Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells[J].J Immunol，2006，177（4）：2080-2087.

[16] Li XC，Turka LA.An update on regulatory T cells in transplant tolerance and rejection[J].Nat Rev Nephrol，2010，6（10）：577-583.

[17] Caplan AI，Dennis JE.Mesenchymal stem cells as trophic mediators [J]. J Cell Biochem，2006，98（5）：1076-1084.

[18] Franchi L，Muñoz-Planillo R，Núñez G.Sensing and reacting to microbes through the inflammasomes[J].Nat Immunol，2012，13（4）：325-332.

[19] Schroder K，Tschopp J.The inflammasomes[J].Cell，2010，140（6）：821-832.

[20] Saiman Y，Friedman SL.The role of chemokines in acute liver injury [J].Front Physiol，2012，3：213.

[21] Zaki MH，Man SM，Vogel P，et al.Salmonella exploits NLRP12-dependent innate immune signaling to suppress host defenses during infection[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（1）：385-390.

[22] Vansaun MN，Mendonsa AM，Lee Gorden D.Hepatocellular proliferation correlates with inflammatory cell and cytokine changes in a murine model of nonalchoholic fatty liver disease[J].PLoS One，2013，8（9）：e73054.

[23] Haga H，Yan IK，Borrelli DA，et al.Extracellular vesicles from bone marrow-derived mesenchymal stem cells protect against murine hepatic ischemia/reperfusion injury[J].Liver Transpl，2017，23（6）：791-803.

[24] Kuo TK，Hung SP， Chuang CH，et al.Stemcell therapy for liver disease： parameters governing the success of using bone marrowmesenchymal stem cells[J].Gastroenterology，2008，134（7）：2111-21，2121.e1-3.

[25] Zheng J，Lu T，Zhou C，et al.Extracellular Vesicles Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Protect Liver Ischemia/Reperfusion Injury by Reducing CD154 Expression on CD4+ T Cells via CCT2[J].Adv Sci （Weinh），2020，7（18）：1903746.

[26] ]Huang GN，Huso DL，Bouyain S，et al.NFAT binding and regulation of T cell activation by the cytoplasmic scaffolding Homer proteins[J].Science，2008，319（5862）：476-481.

[27] Rao J，Cheng F，Yang S，et al.Ag-specific CD4 T cells promote innate immune responses in liver ischemia reperfusion injury[J].Cell Mol Immunol，2019，16（1）：98-100.

[28] Hogan PG.Calcium-NFAT transcriptional signalling in T cell activation and T cell exhaustion[J].Cell Calcium，2017，63：66-69.

[29] Martinez GJ，Pereira RM，Aijo T，et al.The transcription factor NFAT promotes exhaustion of activated CD8+T cells[J].Immunity，2015，42（2）：265-278.

[30] Iverson SV，Comstock KM，Kundert JA，et al.Contributions of new hepatocyte lineages to liver growth， maintenance， and regeneration in mice[J].Hepatology，2011，54（2）：655-663.

[31] Yuan Z，Ye L，Feng X，et al.YAP-dependent induction of CD47-enriched extracellular vesicles inhibits dendritic cell activation and ameliorates hepatic ischemia-reperfusion injury[J].Oxid Med Cell Longev，2021，2021：6617345.

[32] Calleri A，Roggio D，Navarro-Tableros V，et al.Protective effects of human liver stem cell-derived extracellular vesicles in a mouse model of hepatic ischemia-reperfusion injury[J].Stem Cell Rev Rep，2021，17（2）：459-470.

[33] Abe Y，Hines IN，Zibari G，et al.Mouse model of liver ischemia and reperfusion injury：method for studying reactive oxygen and nitrogen metabolites in vivo[J].Free Radic Biol Med，2009，46（1）：1-7.

[34] Tsung A，Sahai R，Tanaka H，et al.The nuclear factor HMGB1 mediates hepatic injury after murine liver ischemia-reperfusion[J].J Exp Med，2005，201（7）：1135-1143.

[35] Zhao G，Fu C，Wang L，et al.Down-regulation of nuclear HMGB1 reduces ischemia-induced HMGB1 translocation and release and protects against liver ischemia-reperfusion injury[J].Sci Rep，2017，7：46272.

[36] Farhood A，McGuire GM，Manning AM，et al.Intercellular adhesion molecule 1 （ICAM-1） expression and its role in neutrophil-induced ischemia-reperfusion injury in rat liver[J].J Leukoc Biol，1995，57（3）：368-374.

[37] Ganey PE，Bailie MB，VanCise S，et al.Activated neutrophils from rat injured isolated hepatocytes[J].Lab Invest，1994，70（1）：53-60.

[38] González-Flecha B，Cutrin JC，Boveris A.Time course and mechanism of oxidative stress and tissue damage in rat liver subjected to in vivo ischemia-reperfusion[J].J Clin Invest，1993，91（2）：456-464.

[39] Anger F，Camara M，Ellinger E，et al.Human mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles improve liver regeneration after ischemia reperfusion injury in mice[J].Stem Cells Dev，2019，28（21）：1451-1462.

[2022-08-12收稿]