噬菌体制剂和杜仲提取物联用减少凡纳滨对虾工厂化养殖前期换水量的可行性探究

魏玉婷 凌涛 徐涛 孙晓林 吕永 郑润玲

摘 要：为探究减少凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）工厂化养殖日换水量的可行性，在凡纳滨对虾工厂化换水养殖的前期（0～34 d），联用噬菌体制剂和杜仲叶提取物。结果表明：该养殖模式下，凡纳滨对虾养殖前期水体中的弧菌数量可得到有效抑制，换水量可减少33.33%，养殖全程结束时，对虾的增重率可提高40.40%。

关键词：凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）；工厂化；节水；噬菌体；杜仲叶提取物

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）因肉质鲜美，一直深受中国消费者的喜爱。“十三五”期间全国凡纳滨对虾养殖量从167.22万吨增长至186.29万吨［1-2］。山东省2021年的凡纳滨对虾产量为21.67万吨［3］，占全国总产量的10.96%，是我国凡纳滨对虾的主要产地之一。对虾工厂化养殖是一种集约化高密度的养殖模式，因具有土地利用率高，节约水资源，养殖环境相对可控，可显著提升对虾养殖产量等特点［4］，被公认为一种可以大力推广的养殖模式。山东省农业农村厅正在开展渔业工厂化养殖的大力推广，目标到2030年将工厂化养殖的规模发展壮大到3 000万立方米水体［5］。潍坊市是山东省较早进行凡纳滨对虾工厂化养殖的地市，目前主要以工厂化换水养殖为主，近些年随着养殖规模不断扩大，养殖密度不断提高，对对虾养殖环境的调控压力也不断增大。当养殖水体发生恶化时，极易爆发弧菌病，严重威胁对虾的健康养殖。除了使用化学消毒产品以外，很多养殖厂不得不增大换水量或换水频次，以保证养殖的顺利进行，这不仅造成水资源浪费，也加大了尾水处理的难度，增加了环境污染的风险。

噬菌体是一种感染细菌和古细菌的病毒，可通过对细菌的裂解作用杀死致病菌，降低其感染概率，达到预防与治疗细菌性疾病的效果，具有专一性强、不易产生抗性、代谢快、易开发及成本低等优点［6］。目前，已经开展了噬菌体在节肢动物、软体动物、棘皮动物以及一些海水鱼类中的研究，结果证明噬菌体或噬菌体鸡尾酒可以有效预防或治疗常见的弧菌病［7］。

本文通过弧菌噬菌体制剂和杜仲叶提取物联合使用控制凡纳滨对虾养殖水体中的弧菌数量，提高凡纳滨对虾的抗逆性，进而减少对虾养殖过程中的换水量，为凡纳滨对虾工厂化换水养殖向着更加节水环保型发展提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点和材料

本试验在潍坊市滨海区恒海生物有限公司的2号和3号两个养殖车间内进行，两个养殖车间的结构和空间布局完全一致，车间内均设有长方型水泥养殖池32个，底面积为31 m2。试验过程中24 h充分曝气，70天以内盐度为10‰左右，70天后盐度逐渐调到18‰左右。

6月18日购入南通海大凡纳滨对虾“快大”品系P5苗，进行25 d标粗，于7月13—16日进行分苗，虾苗规格2 200尾/kg，按700尾/㎡的放养密度转移到养殖车间养殖，7月17日养殖试验正式开始。试验所用弧菌噬菌体制剂和杜仲叶提取物由山东信得生物科技有限公司提供，试验饲料为市售对虾商品料。

1.2 试验管理和分组

3号车间为对照组，从养殖试验开始到第80天池水深60 cm，每日换水50%，从第81天到试验结束池水深80 cm，换水量为62.5%。每周使用过硫酸氢钾消毒一次，并重新泼洒有益菌。

2号车间为试验组，7月17日—8月20日进行为期34 d的节水试验，节水试验期间减少每日换水量，池水深50 cm，日换水率为40%。自7月23日起每周一次泼洒噬菌体制剂，用量为4 mL/m3，连用2 d；同时每周一次使用噬菌体制剂进行拌料投喂，用量为每千克饲料添加噬菌体制剂20 mL，每日2餐，连喂3 d。8月6—20日，每日用杜仲叶提取物替代噬菌体制剂进行拌料，用量为每千克饲料添加4 g，每日添加两次。8月21日节水试验结束，停止向水体和饲料中添加噬菌体制剂和杜叶提取物。8月26日打标和样品采集后使用过硫酸氢钾消毒，向池中加水至水深80 cm、日换水量为62.5%，并泼洒有益菌占位。

2个养殖车间的其他养殖管理完全相同。使用相同的葡萄糖氧化酶、乳酸菌、多维等拌料，相同的光合细菌、芽孢杆菌、乳酸菌进行调水。每日投喂5次，投喂量为体重的4%～6%，每日上午9点左右排水，通过池底的虹吸排污口清除池底的残饵和粪便等污染物。

1.3 样品采集

在开始养殖前（7月16日）对整个车间进行环境消毒，检测养殖用水、养殖虾体弧菌含量。分别在7月27日、8月5日，随机选取2号养殖车间的6个养殖池进行水样采集，同时捞取每个池中的凡纳滨对虾进行虾体采样，检测水样和虾体的弧菌含量。节水试验结束后，于8月26日再次对養殖用水取样进行弧菌含量检测，作为水质检测的负对照。各养殖池水样从现场采集后，分别用无菌海水稀释至适宜浓度梯度，再从各梯度分别取100 μL进行平板涂布计数；虾体取样时，7月16日时取全虾，7月27日和8月5日均解剖取肝胰腺和肠道的混合物，加等体积的无菌生理盐水匀浆，取100 μL匀浆液加900 μL生理盐水进行稀释，再取100 μL进行平板涂布计数。

养殖试验过程中分别于8月12日、26日进行打标，观察对虾生长速度和生长状况。10月5日养殖试验全部结束时，从每个养殖车间随机选6个养殖池，每个池捞取20尾虾，分别测量体重、体长、肝胰腺重，计算增重率、肝体比和肥满度。

1.4 分析方法

1.4.1 弧菌含量检测 采用TCBS培养法。涂布后，28 ℃恒温培养48 h，选取有效菌落（平均菌落数在30～300以内），计数菌落形成单位数目（CFU）。

1.4.2 统计分析

增重率（%）= 100 × （平均末体重 - 平均初体重）/平均初体重；

肥满度（CF）= 100 × 虾体重 / 体长3；

肝体比（%）= 100 × （肝胰腺重 / 虾体重）。

试验统计分析采用计算软件SPSS 15.0。所有数据在进行统计分析之前，先进行正态性和方差齐性检验。评估的变量进行配对样本均数的T检验，以确定两种养殖模式是否对各评价指标产生显著影响（P＜0.05）。

2 试验结果

2.1 噬菌体制剂和杜仲叶提取物联用对凡纳滨对虾养殖日换水量的影响

在整个节水试验期间，对照组（3号车间）的日换水量为297.6 m3，试验组（2号车间）日换水量为198.4 m3，试验组比对照组减少了33.33%的日换水量。

2.2 噬菌体制剂和杜仲叶提取物联用对养殖用水体中弧菌含量的影响

在节水试验期间，试验组的凡纳滨对虾虾体的弧菌含量得到了有效改善，分苗前虾体的弧菌含量为3.40×104 cfu/mL，到养殖的第11天（7月27日）时下降到3.50×102 cfu/mL，随着后期对虾体重的增长，养殖密度增大，到8月5日时凡纳滨对虾虾体的弧菌含量有所升高，含量为5.30×103 cfu/mL，仍然远低于分苗时虾体的弧菌含量。见表1。

养殖池水的弧菌含量在养殖初期下降到3.52×102 cfu/mL，到8月5日增长至2.15×103 cfu/mL，与分苗前时养殖水体中弧菌含量基本相当。然而，在停用噬菌体制剂和杜仲叶提取物后一个星期（8月26日），养殖池水中的平均弧菌含量升高到1.28×104 cfu/mL，是8月5日时的5.95倍，是7月27日时的36.36倍。见表1。

2.3 噬菌体制剂和杜仲叶提取物联用对凡纳滨对虾生长情况的影响

在节水试验期间对两组对虾进行打标称重，8月12日时试验组凡纳滨对虾的体重平均为5 g，对照组为2.5 g；到8月26日节水试验结束时，试验组对虾的平均体重为10 g，对照组的对虾体重为5.15 g。试验组的增重速度明显高于对照组（见图1），且对虾活力都很强，体色正常，虾体无明显破损，蜕壳时间较一致，基本未发现蜕壳不遂的虾或软皮虾。

养殖试验结束时，采用配对样本t检验以判断噬菌体制剂和杜促叶提取物联用对凡纳滨对虾生长情况的影响。结果显示噬菌体制剂和杜仲叶提取物联用对凡纳滨对虾的末体重、体长和增重率在0.01显著性水平下呈现差异（P＜0.01），肝体比在0.05显著性水平下呈现差异（P＜ 0.05），肥满度和出肉率未产生显著性差异（P＞0.05）。进一步比较其均值发现，试验组凡纳滨对虾的末体重、体长和增重率均高于对照组（P＜0.01），肝体比低于对照组（P＜0.05），与对照组相比试验组的增重率提高了40.40%（见表2）。

3 讨论

弧菌病是对虾养殖业中一种常见的细菌性疾病，给对虾养殖业造成了很大损失，被认为是对虾养殖业的一个持续性威胁。凡纳滨对虾养殖过程中常见的弧菌主要为哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和霍乱弧菌［8］。在水产养殖过程中利用噬菌体进行弧菌疾病的治疗，已经在对虾［9］、牡蛎［10］等水生动物中得到了验证。Chen等［11］发现利用患病虾的肠道和养殖废水中的5种致病弧菌分离得到的5种新噬菌体，制成噬菌体组合物可以有效抑制致病菌的生长。有报道指出，养殖水体中引起对虾感染发病的弧菌密度阈值为104 cfu/mL［12］，本研究中采用噬菌体制剂和杜仲叶提取物联用的方式控制养殖水体的质量，在日换水量减少了33.33%的情况下，并没有导致养殖水体中弧菌含量的升高，且完全控制在引起对虾感染发病的弧菌密度阈值范围之内。然而，当停用了噬菌体制剂和杜仲叶提取物7 d后，各水池的平均弧菌含量上升到1.28×104 cfu/mL，对虾感染弧菌的风险大大增加。在节水试验期间，凡纳滨对虾虾体的弧菌含量得到明显的控制，各养殖池也无明显发病现象，说明噬菌体和杜仲叶提取物联用可以在减少养殖换水量的情况下，保证凡纳滨对虾的健康生长。

杜仲叶提取物中的主要成分为绿原酸、丁香脂素双糖苷、地普黄酮，具有杀菌抑菌和抗氧化作用，能消除动物体内过多的自由基，从而提高机体的非特异性免疫［13］。在凡纳滨对虾饲料中添加杜仲可以显著提高凡纳滨对虾肌肉和内脏团的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性，并且相应降低丙二醛值［14］。此外，在凡纳滨对虾的养殖过程中使用杜仲叶提取物还可以提高对虾肝胰腺组织中的B细胞数量，提高对虾肝胰腺的消化吸收能力［13］。本研究中，在凡纳滨对虾养殖前期减少日换水量的同时，8月6—20日连续向对虾日粮中加入杜仲叶提取物，8月12日和26日两次打标结果显示，试验组的虾体重为对照组的2倍，幼虾阶段的生长效果明显提高。到养殖试验结束时，试验组对虾的增重率比对照组提高43.04%，推测可能是杜仲叶提取物对幼虾肝胰腺和肠道的健康发育起到了重要的作用。

4 结论

在凡纳滨对虾工厂化换水养殖的前期（0～34 d），通过噬菌体制剂和杜仲提取物联用可以有效控制水体中弧菌含量，保证凡纳滨对虾的健康生长，日换水量可减少33.33%，全程养殖结束时，凡纳滨对虾的增重率提高了40.40%。

参考文献：

[1]农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会.中国渔业统计年鉴[M].北京：中国农业出版社，2017：26，34.

[2] 农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会.中国渔业统计年鉴[M].北京：中国农业出版社，2021：22，24.

[3] 农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会.中国渔业统计年鉴[M].北京：中国农业出版社，2022：26，34.

[4] 陳钊.凡纳滨对虾工厂化养殖系统氮收支与水环境调控[D].青岛：中国海洋大学，2018.

[5] 山东省农业农村厅，山东省养殖水域滩涂规划（2021-2030年）[A/OL].（2021-8-11）[2022-11-25]. http：//www.shandong.gov.cn/art/2021/8/11/art_100152_10294048.html

[6] 陈愿，张永安，周洋.噬菌体在水产养殖业中的研究进展[J].水产学报，2021，45（9）：1605-1615.

[7] 崔惠敬，耿慧君，王丽丽，等.噬菌体治疗海水养殖动物常见细菌性疾病的研究进展[J].国外医药抗生素分册，2019，40（5）：445-450.

[8] 李君怡，吴秋平，周疆，等.凡纳滨对虾弧菌病及其防治方法研究进展[J].水产科技情报，2022，49（2）：106-111.

[9] STALIN N，SRINIVASAN P.Efficacy of potential phage cock-tails against Vibrio harveyi and closely related Vibrio species isolated from shrimp aquaculture environment in the south east coast of India[J].Veterinary Microbilogy，2017，207：83-96.

[10] 于云娟.副溶血弧菌噬菌体qdvp001的分离鉴定及其在牡蛎净化中的初步应用[D]. 青岛：中国海洋大学，2012.

[11] CHEN L.，FAN J Q，YAN T W，et al.Isolation and chracterization of specific phages to prepare a cocktail preventing Vibrio sp.Va-F3 infections in shrimp （Litopenaeus vannamei） [J].Frontiers in Microbiology，2019，10：2337.

[12] 于占國，林风翱，贺杰.异养细菌与虾病关系的研究[J].海洋学报，1995，17（3）：85-91.

[13] 李军涛，李金宝，冼健安，等.杜仲叶提取物对凡纳滨对虾生长、免疫酶活性及肝胰腺组织的影响[J].南方农业学报，2018，49（9）：1858-1864.

[14] 郭永军，邢克智，陈成勋，等.八种单方中草药添加剂对凡纳滨对虾健康指标的影响[J].中国水产，2009（1）：54.

（收稿日期：2022-11-25；修回日期：2023-03-14）