滨州地区凡纳滨对虾苗种虾肝肠胞虫病的调查和分析

崔玮琪 冯晓 宋瑞强 杨勋 杨双 苏兆军

摘 要：为全面、系统地了解滨州市地区凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）苗种携带虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）及爆发情况，对滨州地区37家凡纳滨对虾养殖池塘随机采集对虾苗种样本，根据SC/T 7232-2020 《虾肝肠胞虫病诊断规程》采用套式PCR法进行对虾苗种虾肝肠胞虫的检测，检测结果表明滨州地区虾肝肠胞虫阳性检测率为4.84%，同时监测虾肝肠胞虫病发病池和未发病池的水质，发现发病池的水体中pH值、COD等指标并没有显著差异，说明虾肝肠胞虫病爆发并不是由于养殖池水质导致的。

关键词：凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）；虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）；PCR；检出率

近年来由于对虾疫病的频繁爆发，使得对虾养殖业受到了较大的冲击。其中有一种常见的疾病在泰国、印度、越南和中国等国家中流行，可造成对虾苗种生长极其缓慢或停止［1］，其病原微生物为虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。

EHP的流行率较高，已经成为威胁我国养殖业的一个严重病原。我国于2013年在浙江台州养殖的凡纳滨对虾的肝胰腺中首次检出EHP，此后在我国沿海地区陆续发现大量EHP感染病例。2015年辽宁营口的对虾EHP检出率为34.6%［2］；粤西地区养殖对虾EHP检出率为41.38%［3］；浙江舟山养殖对虾EHP检出率为85.19%［4］，检出率逐年上升。本文就滨州地区EHP的发病率进行调查分析，以期为建立有效防控技术方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

调查区域包括滨州市沾化区、无棣县、博兴县凡纳滨对虾工厂化养殖池，随机抽取37家苗种养殖场进行抽检（选取苗种日期相近的养殖场）。此次调查从3月开始到7月结束，每七天为一个周期进行取样检测，共计得到样品195份。

1.2 样品EHP检测

1.2.1 样品前处理 取凡纳滨对虾虾苗全虾在已灭菌的研钵中研磨，将研磨后的组织放在无菌的离心管中，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 总DNA的提取 取研磨好的样品约20 mg左右，采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 DNA提取试剂盒进行对虾样品总DNA的提取，提取后采用-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 检测 根据SC/T 7232-2020《虾肝肠胞虫病诊断规程》采用套式PCR方法进行扩增，套式PCR扩增体系所需引物序列见表1，PCR扩增反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，30个循环，最后4 ℃保温。产物经1%琼脂凝胶电泳检测后， 送至生工生物工程（济南） 股份有限公司测序，测序结果与NCBI数据库进行进一步的基因序列对比，进一步验证结果的准确性。

2 結果与分析

将两轮阳性PCR扩增产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库中EHP的致病基因序列进行比对，结果显示PCR扩增出的阳性片段与NCBI数据库中的EHP致病基因的序列相似度为98%。部分对虾样品的电泳图见图1和图2。

3 讨论

3.1 滨州地区EHP感染情况

本研究对2022年3—7月期间滨州地区的凡纳滨对虾苗种养虾池EHP的感染情况进行了调查与分析，结果表明，EHP的发病率在4.84%，主要集中在4—5月。通过对发病池和未发病池的水质进行监测发现，其pH值、COD等指标并没有显著差异。

3.2 病因分析

虾肝肠胞虫病（Enterocytozoon hepatopenaei disease）也称作肝胰腺微孢子虫病（Hepatopancreatic microsporidiosis， HPM），最早是在马来西亚养殖斑节对虾的肝胰腺中发现的［5-6］，2004年研究人员发现泰国养殖斑节对虾体中也存在微孢子感染，Tourtip等 （2009）将这类感染对虾肝胰腺的微孢子虫正式命名虾肝肠胞虫，此后在越南、印度、中国、委内瑞拉等国家几乎同时检测出EHP，目前EHP已经成为危害我国水产养殖业的主要病原之一。

虾肝肠胞虫在分类上属微孢子纲（Microsporea），肠胞虫科 （Enterocytozoonidae） ，肠胞虫属（Enterocytozoon）［7］，是一种可感染多种真核生物的专型细胞内寄生真菌。成熟的虾肝肠胞虫的孢子呈椭圆形，具有极丝、1个细胞核和1 个后位空泡，由几丁质构成的孢包裹，大小为（1.1±0.2）μm×（0.7±0.1）μm［8］。患病对虾肝胰腺和肠道颜色较深，严重者肝胰腺萎缩，生长缓慢，个体明显偏小，感染群体生长差异明显增大。正常养殖条件下，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大量、急性死亡。体长相同时，发病群里的平均体重约为EHP阴性的70%。

滨州地区EHP发病率为4.84%，相对较低，造成原因有两个方面，一是EHP的传播有两种形式：一种是垂直传播，即通过亲虾传播给子代；另一种是水平传播，即摄食寄生EHP的鲜活饵料、病虾、死虾或环境中的孢子体而感染［9-10］。通过对发病池和未发病池水质进行监测发现两者差异不显著，可能是由于采集的样品为虾苗，尚未摄食鲜活饵料，因此未发生水平传播，没有造成大范围的传染。二是由于2020年起，为从源头严格控制重大水生疫病的传播，山东省开始实行水产苗种产地检疫工作，加大对出厂苗种的管控力度，提高了水产苗种质量，降低了疫病发生率。

3.3 防控措施

苗种作为最重要的投入品，处于养殖生产中的首要环节，实施苗种检疫可以从源头切断疫病的传播途径，因此养殖企业购买苗种时应购买具有资质的检测机构检测合格的苗种。

水质是对虾养殖过程中第二个重要环节。水质管理的好坏，直接决定着对虾养殖的成败，因此养殖池中的水要进行彻底消毒后方可使用，且要时时监测养殖水的指标。

出现对虾生长缓慢现象的养殖池要进行彻底的清塘和消毒，防止病毒继续传播。

参考文献：

[1]

BIJU N，SATHIYARAJ G，RAJ M，et al.High prevalence of Enterocytozoon hepatopenaei in shrimps Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei sampled from slow growth ponds in India[J].Diseases of aquatic organisms，2016，120（3）：22-30.

[2] 王博雅，王力，刘美如，等.凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析[J].大连海洋大学学报，2017，32（2）：150-154.

[3] 陈禄芝.粤西地区凡纳滨对虾虾肝肠胞虫、传染性皮下和造血组织坏死病毒感染情况的初步调查[J].渔业研究.2016.38（4）：273-280.

[4] 施慧，许文军，谢建军，等.舟山地区大棚凡纳滨对虾生长缓慢病因的调查分析[J].中国水产科学，2017，24（2）：387-394.

[5] ANDERSON I G，SHARIFF M，NASH G.A hepatopancreatic microsporidian in pond-reared tiger shrimp，Penaeus monodon from Malaysia[J].Journal of Invertebrate Pathology，1989， 53（2）：278-280.

[6] ARANGUREN L F， HAN J E， TANG K F J.Enterocytozoon hepatopenaei （EHP） is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease （AHPND） and septic hepatopancreatic necrosis （SHPN） in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei[J].Aquaculture，2017，471：37-42.

[7] 胡吉卉，李正民，段健誠，等.虾类肝肠胞虫流行病学研究进展[J].水产养殖，2020，41（11）：1-4，10.

[8] 王维娜，王安利，陈丽，等.斑节对虾体内微孢子虫的超微结构[J].动物学报，2001（47）：78-81.

[9] 许杰，邓威，李军，薛淑霞，等.虾肝肠胞虫（EHP）流行病学与检测技术研究进展[J].中国动物检疫，2018，35（2）：64-68.

[10] 骆云慧，石坚，方磊，等.虾肝肠胞虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2016，46（7）：847-852.

（收稿日期：2023-02-15；修回日期：2023-02-24）