肝乐颗粒治疗慢性乙型病毒性肝炎的作用机制*

陶庆雪，施卫兵，常硕，郭锦晨，许文彬

1 安徽中医药大学研究生院 安徽合肥 230012

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

3 新安医学教育部重点实验室 安徽合肥 230038

慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是我国现阶段流行广泛、危害严重的传染病之一，每年由乙肝导致死亡人数高达90万，我国CHB相关的肝硬化和肝癌患者占比约60%和80%[1-2]。现大量研究证实中医药在保肝降酶、抗纤维化及改善CHB患者的焦虑、抑郁状态等方面具有独特优势，能效弥补单一核苷（酸）类似物和干扰素抗病毒治疗的不足，中医辨证联合抗病毒已成为我国治疗慢乙肝的主要方式[3]。

传统医学认为正气不足加之湿热毒邪乘袭，复因情志失调、饮食失节、劳倦失度可诱发慢乙肝。病久毒邪深入血分，湿热盘踞中焦，易耗伤肝肾之阴，阴血既亏，无以涵养肝木，常致肝郁不疏，横犯脾土，终以肝郁脾虚为核心矛盾。肝乐颗粒是安徽省中医院感染科以逍遥散为底方化裁研制的临床效方，由柴胡、黄芪、白芍、白术、茵陈、板蓝根、泽兰、薏苡仁等11味中药组成，具有调肝理脾、清热祛湿、活血解毒之功，恰合慢乙肝标实本虚之机，前期研究证实肝乐颗粒联合抗病毒治疗不仅能强化对慢乙肝患者乏力、纳差、肝区不适等临床症状的改善，并能有效降低丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平，减轻肝损伤[4]。但其分子生物学机理尚不明确，现采用网络药理学方法探究肝乐颗粒治疗CHB作用机制，将为临床推广应用本方提供新的视角与思路，为中医药调治CHB提供更多科学依据。

工具与方法

1 数据库与软件

见表1。

表1 数据库与软件信息

2 肝乐颗粒活性成分的筛选与靶点收集

在TCMSP平台，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，结合中国知网、Pubmed文献数据以补充，最后利用Uniprot数据库获取Gene symbol集。

3 “药物—活性成分—靶基因”互作网络构建

为明确药物与药物及药物与靶蛋白的相互作用，将1.1项所得数据分别建立网络文件和属性文件后导入Cytoscape3.7.0软件进行可视化分析。

4 CHB相关靶蛋白汇总

分 别 以“chronic hepatitis B infection”、“chronic type B viral hepatitis”、“chronic hepatitis B”为关键词，依次检索Gene Cards数据库、OMIM数据库、DisGeNET数据库、TTD数据库、DrugBank数据库和NCBI数据库，将各数据库信息合并，即为CHB疾病靶点集。

5 “药物—疾病”共同靶点获取与PPI网络构建

将1.1和1.2项数据导入在线绘图与数据分析工具，生成韦恩（venny）图。将交集数据上传至STRING11.5数据库构建蛋白-蛋白互作（PPI）网络，并保存tsv文件。将文件导入CytoScape进行可视化与属性分析。

6 “肝乐颗粒成分—慢乙肝靶点”的GO与KEGG分析

将核心靶蛋白上传至DAVID 6.8数据库，设置PValue＜0.05，按降序分别筛选基因本体分析GO的前10与KEGG通路富集分析的前20，并作图展示。

7 构建“肝乐复方-成分-靶点-通路-CHB”关联网络

汇总并建立复方活性成分、富集通路及通路差异表达的靶点的网络属性文件后导入Cytoscape可视化，进一步明确发挥疗效的主要活性成分与靶点。

8 分子对接验证

在PubChem数据库下载活性成分2D.sdf文件，利用Chem3D进行结构优化。在RCSB PDB数据库下载靶蛋白3D.pdb文件，通过PyMOL2.4.0及Autodock-Tools1.5.7对配体和受体进行预处理后保存为pdbqt文件，设置活性口袋后采用Autodockvina1.1.2进行对接。

结 果

1 肝乐颗粒活性成分筛选与靶点收集

据ADME条件筛选获得总化合物161个，柴胡皂苷及黄芪甲苷等成分虽不满足筛选条件，但综合《中药药理学》（全国高等中医药院校规划教材（第十版）·中国中医药出版社）及文献研究已证实为中药主要活性成分，故仍纳入本研究。去重后共130个有效活性，其中共有成分13个，相应靶点1809个，删除重复值后245个，见表2，表3。

表2 肝乐颗粒活性成分与靶点预测信息

表3 肝乐颗粒药物共有成分信息

2 构建肝乐颗粒“潜在活性成分-靶基因”网络图

图中橙色圆形为药物成分，橙色箭头形状为药物共有成分，蓝色圆形为各中药，绿色菱形为药物靶点，

依据degree呈现节点面积及字体大小，面积越大说明该成分及靶点基因越重要。

网络中共352个节点，1916条边，其中药物共有成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等对应的靶点数目最多，这也反映了它们可能是肝乐颗粒发挥作用的核心，且不同药物成分能够作用于同一靶点或不同靶点协同发挥功效，见图1。

图1 肝乐颗粒的“药物—活性成分—靶点基因”网络图

3 CHB相关靶点筛选收集

依次检索关键词获取CHB相关靶点，在GeneCards数据库中筛选≥Score中位数靶点750个，最终获得1729个CHB相关靶点，见图2。

图2 慢乙肝相关靶点

4 “肝乐颗粒—CHB”重合靶点与PPI网络构建

获得交集靶点122个，见图3。在String数据库，设定“highest confidence”（＞0.9），余为默认设置，隐藏EIF6、PYGM、PLB1等9个无关联的游离节点后得到 PPI网络，通过CytoScape内置插件分析靶点拓扑网络属性值，以下靶基因可能是参与肝乐颗粒调治CHB的主要靶点，见图4及表4。

图3 肝乐颗粒与CHB交集图

图4 蛋白互作网络构建及拓扑分析

表4 两种算法得到的交集靶点

5 GO与KEGG富集分析

GO分析共495个条目过程，BP分析可知核心靶点与病毒基因的转录、复制及炎症反应等密切相关，肝乐颗粒主要参与RNA聚合酶II启动子转录的正、负调控、细胞凋亡与基因表达的负调控、炎症反应、肝再生、细胞对病毒的反应等295条生物过程。重合靶点的主要分子功能（MF）包括酶结合、DNA结合、转录因子结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等。此外，细胞组分富集显示，胞浆（GO：0005829）、核（GO：0005634）、线粒体（GO：0005739）及膜筏（GO：0016020）被认为是核靶的主要组成，见图5。

图5 GO富集分析

KEGG分析是将靶点富集到相应生物学通路上，借以预测与疾病的联系。本次富集177 条信号通路，其中癌症通路、乙肝病毒、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶（AKT）通路富集最显著，主要参与炎症反应与免疫调控作用。剔除卡波西肉瘤疹病毒感染、前列腺癌等无关通路，汇总纳入后续差异富集度较高的JAK-STAT信号通路、NF-κ B信号通路、细胞因子及其受体相互作用信号通路、Th1 and Th2 细胞分化等信号通路，主要涉及细胞分化、凋亡及氧化应激等的信号通路，见图6。

图6 KEGG富集分析

6 构建“肝乐复方-成分-靶点-通路-CHB”关联网络

基于KEGG富集分析与基因差异表达的相互映射，建立肝乐颗粒调治慢乙肝的系统关联网络，见图7。由图1、表1与图7的交合可以推测柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄芪甲苷（Ⅳ）、槲皮素、杧柄花素等是肝乐颗粒发挥疗效的的必要成分，见表5。

表5 肝乐颗粒部分主要活性成分

图中橙色箭头代表与慢乙肝密切相关的前20条通路；通路富集差异基因487个，去重后共92个，其 中 IL-6、IL-1β、TNF-α、JNK、RELA、MAPK3、MAPK8等靶点在多条通路上均显著富集。结合图1，基于靶点-药物成分相互映射，获得药物成分69种，以药物共有成分的槲皮素、山奈酚、杧花柄素等为代表。

7 分子对接验证

选取表3中排名前10种活性成分和柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及黄芪甲苷（Ⅳ）与核心靶蛋白进行分子模拟对接，对接结合能均≤-6.1kcal/mol，其中对接最稳定的是川陈皮素与MYC的结合（-10.2 kcal/mol），其次是柚皮素与RELA的结合（-10 kcal/mol），即本研究的活性成分均能与相应靶点稳定结合，进而发挥调治慢乙肝的作用，见图8。选取6对结合体进行可视化展示，见图9。

图8 活性成分-靶蛋白对接热图

图9 活性成分-核心靶点对接模式展示

讨 论

肝乐颗粒主要是针对急、慢性肝炎及肝纤维化患者的特色院内制剂，方中柴胡入肝胆经，乃厥阴之报使，升发肝胆之气，疏肝解郁；黄芪味甘，微温，入脾经而善补中气，两者相合，旨在肝脾同调；白芍养血柔肝，白术健脾复运，辅以茯苓、猪苓、薏苡仁，渗湿利水兼补脾，标本同治祛邪实，三者与芪术相伍又能“助土德以升木”；泽兰活血利水，枳壳行气宽中，茵陈利胆退黄清湿热，板蓝根凉血解毒清实热，此四味乃契合慢乙肝“邪毒深伏血分，湿热盘踞中焦，致肝郁不舒，脾虚湿盛”基本病机之妙用，使气动血行湿亦化，毒解热清脏腑调。

综合网络药理学及相关文献报道发现肝乐颗粒参与调治CHB的化合物有130种，发挥核心功效的高达69种，其中以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄芪甲苷（Ⅳ）及黄酮类化合物（如槲皮素、杧花柄素）为代表。研究表明，黄芪甲苷（Ⅳ）能够介导多条炎症转导通路并抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的表达及肝组织JNK、p38MAPK及NF-κB的磷酸化，发挥抗炎、抗纤维化的功效[5-6]。而黄酮醇类化合物槲皮素被称为保肝剂，亦能有效改善肝纤维化及肝硬化[7]。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d作为评定柴胡质量的主要标记化合物，已被证实具有抗炎、抗病毒、抗肝纤维化及免疫调节等药理活性[8-9]。据报道，慢乙肝患者比常人更易产生焦虑、抑郁等不良情绪[10]，杧花柄素则能通过NF-κB p65通路的介导逆转基底外侧杏仁核（BLA）中NMDA、GluA1、GABAA受体及PSD95的上调性表达，进而发挥抗焦虑、抑郁的作用[11]。

基于PPI网络拓扑分析（图4与表5）及富集通路基因的差异表达，推测IL-6、 TNF-α及JNK可能是肝乐颗粒调治CHB的核心靶点。临床研究表明CHB感染是多种免疫反应和细胞因子复制的过程，而炎症反复存在是CHB进展为肝硬化甚至HCC的重要因素。白细胞介素（IL）作为重要的免疫调节因子和炎症介质，在HBV持续感染复制并损害CD8+T细胞功能时，被诱导表达上调并产生炎症级联反应[12]。有学者研究发现高表达的TNF-α可正反馈IL-6分泌与肝星状细胞增殖，进一步加重肝损伤及肝纤维化程度[13]。另有报道指出适当水平的TNF-α可以激活内源性抗病毒APOBEC蛋白并加强CD8+T细胞的抗病毒活性，进而诱导HBV的cccDNA降解和细胞凋亡[14]。JNK则是MAPK途径中重要的信号通路，已有研究证实JNK在多种癌细胞中高度表达，并可能参与肝细胞癌的增殖与分化[15-16]。综上研究可以明确IL-6、TNF-α、JNK等靶点可能在防治慢乙肝疾病进展、恶化中有关键作用。

KEGG富集显示肝乐颗粒主要介导乙肝病毒、癌症、免疫调节、炎症反应、信号转导等信号通路，其中乙肝病毒、脂质与动脉粥样硬化、癌症通路、MAPK和PI3K-Akt信号通路富集程度最高。相关研究已证实MAPK和PI3K-Akt信号通路与肝纤维化、肝癌等肝损伤密切相关[18-19]。P13K/AKT通路是细胞分化、增殖和代谢及蛋白质合成的调节中心，当细胞被HBV感染后，可激活该通路并降低糖原合成激酶3-β（GSK3β）的表达，促使病毒细胞存活与增殖[20]。亦有学者发现通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路上PI3K、AKT、mTOR等关键靶蛋白的表达，能够有效抑制肝癌细胞的增殖、转移并促进其凋亡[21]。姜辉[22]等已证实肝乐颗粒能够抑制PI3K通路的下游转录因子NF-κB的表达，从而改善大鼠肝纤维化。常用抗病毒药TDF（替诺福韦酯）抗纤维化作用的发挥，亦与抑制PI3K/Akt/mTOR通路因子的磷酸化，诱导HSC（肝星状细胞）凋亡密切相关[23]。MAPK 作为传递细胞信号的使者，在调控细胞生长发育过程中发挥关键作，并与氧化应激、炎症反应等生理病理过程有关[24-25]。研究表明，通过下调肝组织中JNK、ERK和p38MAPK的表达，抑制MAPK的异常激活，能够有效防治急性肝损伤[26]。以上研究从不同角度证实了肝乐颗粒通过PI3K-Akt和MAPK信号途径的介导，具有降低肝损伤、改善纤维化、调节肝癌进展的确切疗效机制。

将对接结果经PyMOL程序可视化后，发现柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄芪甲苷及槲皮素等均能与氨基酸残基形成氢键和疏水作用，进而紧密地结合在蛋白的口袋囊腔中，进一步验证了本研究对肝乐颗粒有效成分及核心靶点预测的可靠性。

通过客观地分析肝乐颗粒与慢乙肝交集靶点映射构建的核心关系网络及成分、靶点的拓扑属性，初步明确了肝乐颗粒可能通过参与基因的转录与表达、细胞的凋亡及其对病毒的反应、氧化应激和肝再生等生物学过程，调控乙肝病毒、癌症通路、免疫调节及炎症反应等信号通路，进而发挥治疗慢乙肝的药理作用。从基因、蛋白、信号通路等不同组学层面挖掘分析药物活性成分与疾病的内在联系，有助于理解肝乐颗粒调治CHB多靶点、多通路的复杂整体性，进而明确传统中医药疗效的科学内涵，为肝乐颗粒的开发应用奠定了理论基础，针对肝乐颗粒在体内的具体作用机制，本课题组将进一步实验验证。