基于“异病同治”理念探讨丹栀逍遥散治疗干眼和抑郁症的网络药理学机制*

王紫艳，时健，姚小磊，彭清华

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410021

丹栀逍遥散是逍遥散加上栀子、牡丹皮组成，在《内科摘要》中首次记载，主治肝郁脾虚血热之证，是调节异常情志的经典名方，具有健脾养血、清热疏肝等作用，以柴胡为君，白芍、当归为臣，三药合用使郁结之肝气调畅，佐以益气健脾之白术、生姜、甘草及茯苓，配合丹皮、栀子清郁结日久所化之火，少许薄荷辛透肝热，诸药合用，达到“疏肝、健脾、清血热”之效[1]。对肝郁化脾虚兼有热尤为适合，可治疗肝郁引起的多种病症[2]。

对于丹栀逍遥散的使用，国医大师伍炳彩灵活运用丹栀逍遥散治疗血小板减少症、更年期综合征、指甲异常等疾病，充分体现其异病同治的精妙[3]。在干眼和抑郁的治疗上也充分体现“异病同治”。在《中医眼科学》中对于白涩症—“干眼”肝经郁热证的患者采用丹栀逍遥散进行治疗，现代医家临床应用丹栀逍遥散治疗肝经郁热证的干眼患者疗效显著[4]。回世洋等[1]通过观察丹栀逍遥散加减联合人工泪液对比单纯人工泪液治疗肝经郁热证的干眼患者，发现加用丹栀逍遥散的患者全身症状改善，且泪液分泌量、BUT以及CFS等理化指标明显改善。对于抑郁的治疗也同样取得了显著的疗效，徐婷通过观察丹栀逍遥散联合盐酸氟西汀胶囊对比单纯盐酸氟西汀胶囊治疗抑郁症患者，发现丹栀逍遥散能够控制患者的临床症状，改善患者的认知功能，并对神经营养因子进行调控，改善患者的预后以及减少不良反应的发生[5]。

干眼与抑郁关系密切，但是证据稀少，且对于其潜在的发病机制知之甚少，有学者认为干眼患者局部炎症因子增加，与抑郁患者血液中的同样增加的炎症因子相似[6]，可能会导致相似的病理生理过程，从而出现上述现象，进而对其治疗带来了巨大的挑战。丹栀逍遥散作为中药复方，本身化学成分复杂，其临床疗效也是通过多种药物多靶点、多途径作用于疾病，丹栀逍遥散以疏肝泄热、养血健脾功效为核心治疗干眼和抑郁，其成分-靶点-通路-疾病间相互作用的网络不清晰，使得该方的现代应用受到一定的局限，也是现在急需解决的问题。故此次研究的目的在于使用网络药理学和分子对接的方法分析干眼与抑郁之间的共有的基因蛋白以及可能相关的生物过程，并挖掘丹栀逍遥散“异病同治”干眼和抑郁的潜在的机制。

资料与方法

1 丹栀逍遥散的药物活性成分及对应的靶点检索

丹栀逍遥散的药物组成成分有牡丹皮、栀子、当归、白芍、柴胡、茯苓、白术、薄荷、生姜、甘草，在TCMSP平台上检索各药物，将口服生物利用度设定为≥30%，药物相似性设定为≥0.18，筛选得到药物的有效成分；以此有效成分在TCMSP数据库检索得到药物的作用靶点，将其与结合Uniprot数据库一起导入perl软件中，剔除无法匹配基因的靶点，其余靶点蛋白转换为genensymbol。

2 干眼和抑郁疾病相关靶点检索及交集靶点的可视化

在 DrugBank、TTD、OMIM、PharmGkb、GeneCards数据库以"DryEye"为关键词搜索得到干眼的相关靶点，以“depression”为关键词搜索得到抑郁的相关靶点，将丹栀逍遥散有效成分作用靶点、干眼疾病靶点以及抑郁疾病靶点取交集作为药物作用于疾病的潜在靶点，绘制药物-疾病靶点的Venn图。

3 构建丹栀逍遥散-干眼-抑郁靶点的PPI网络

将交集靶点导入String网络平台，蛋白物种设置为“Homosapiens”，置信度设定为＞0.9，筛除游离的靶点，构建PPI网络。图中的节点代表蛋白靶点，边代表靶点之间的关系。将节点关系信息导入到Cytoscape 3.9构建网络图，并通过degree值明确丹栀逍遥散治疗干眼与抑郁的共同核心靶点。

4 GO分析与KEGG

将药物与疾病的共同靶点导入R x64 4.11软件中，进行生物学过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及细胞成分（cellular component，CC）的 GO 功能富集分析以及KEGG富集分析，以明确丹栀逍遥散治疗干眼与抑郁的调控通路。

结 果

1 丹栀逍遥散成分-靶点网络

根据TCMSP数据库的结果，共得到药物活性成分187种，包括牡丹皮11种、栀子15种、当归2种、白芍13种、柴胡17种、茯苓15种、白术7种、甘草92种、生姜5种、薄荷10种，得到药物作用靶点共计个，其中牡丹皮237个，栀子363个，当归69个，白芍123个，柴胡348个，茯苓30个，白术23个，甘草1769个，生姜75个，薄荷181个，将得到的数据导入perl软件中，得到药物有效靶点3095个。最后利用Uniprot数据库将靶点蛋白转换为gene symbol，并进行筛重，共得到对应药物基因2727个。

2 干眼和抑郁的疾病交集靶点-药物靶点网络

在 DrugBank、TTD、OMIM、PharmGkb、GeneCards数据库分别以“depression”为关键词，搜索抑郁症的疾病靶点，以“dry eye”为关键词，搜索干眼的疾病靶点，共计得到抑郁症疾病靶点3663个，干眼的疾病靶点3020个，将药物靶点及疾病靶点导入Draw Venn Diagram中，并绘制venn图（图1）。从图中可以看出，丹栀逍遥散治疗抑郁的作用靶点161个，治疗干眼的作用靶点162个，共同靶点132个，另可看出抑郁与干眼的靶点具有较高的重合度，说明抑郁和干眼极有可能有相似的作用机制，132个共同靶点说明丹栀逍遥散在治疗这两种疾病的过程中起到重要作用。

图1

3 丹栀逍遥散不同药物成分与药物靶基因的调控网络

将丹栀逍遥散不同的药物成分与药物靶基因想互作用信息导入Cytoscape 3.9 软件中，利用132个药物靶点反向筛选得到122个活性成分，如图2，其中深紫色代表柴胡，灰色代表生姜，青色代表甘草，黄色代表白术，蓝色代表白芍，橙色代表牡丹皮，粉色代表栀子，绿色代表当归，紫色代表薄荷，红色代表茯苓。

图2

4 丹栀逍遥散治疗干眼-抑郁的PPI网络与核心蛋白

使用STRING数据库，筛选出置信度＞0.9的蛋白关系，构建丹栀逍遥散治疗干眼-抑郁的PPI网络，结果包括132个节点，436条边，平均节点度值6.61，以节点度值表示靶点连线的边数。度值大说明其可能是关键的有效活性成分靶点，和疾病靶点相互作用关系密切，在网络中起到重要的作用（图3）。

图3

将靶点蛋白相互作用信息导入Cytoscape 3.9 软件中，利用“CytoNCA”计算出各节点的介数中心性（Betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（Eigenvenctor centrality，EC）、基于局部平均连通性的方法中心性（Local Average Connectivity-based method centrality，LAC）和网络中心性（Network centrality，NC），大于等于以上6组数据的中位值则符合标准，其中DC的中位数为5.5，BC的中位数为50.81490078，CC的中位数为0.1018149825，EC的中位数为0.0412268005，LAC的中位数为1.666666667，NC的中位数为2.5，筛选出大于等于中位数的靶点蛋白有32个，再利用“CytoNCA”计算32个靶蛋白的以上6组数据的中位值，其中DC的中位数为9.5，BC的中位数为10.2623952355，CC的中位数为0.574074074，EC的中位数为0.1417232755，LAC的中位数为4.8194444445，NC的中位数为6.100883838，筛选出大于等于中位数的靶点蛋白有14个，如图4，从图中可以看出 MYC、HIF1A、ESR1、EGFR、CDKN1A、TP53、FOS、STAT3、MAPK3、STAT1、MAPK14、AKT1、MAPK1、CASP3等靶点蛋白可能是丹栀逍遥散治疗干眼-抑郁的关键靶点。

图4

5 GO基因富集分析

使用R x64 4.1.1软件对上述丹栀逍遥散与干眼-抑郁交集基因进行GO功能富集分析，根据P≤0.05，共筛选出2467个GO条目。包括75条细胞组成（cellularcomponent，CC）、178条分子功能（molecularfunction，MF）和 2214条生物过程（biologicalprocess，BP），根据P值将所有条目排序，分别取显著性较高的前10种绘制气泡图（图5），可以看出从生物过程分析，丹栀逍遥散治疗干眼-抑郁主要与脂多糖反应、对氧化应激的反应、对异种生物刺激的反应、对金属离子及辐射的反应等相关。从分子功能分析，治疗主要涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、磷酸酶结合、细胞因子受体结合等。细胞成分主要涉及膜筏、膜微域、囊泡腔、质膜外侧等。

图5

6 KEGG通路富集分析

使用R x64 4.1.1软件对上述丹栀逍遥散与干眼-抑郁交集基因进行KEGG通路富集分析，根据P≤0.05，得到显著富集的相关通路176条，按富集显著度排列，选取30条KEGG通路（图6）。

图6

通过文献查阅，发现与丹栀逍遥散治疗干眼-抑郁较密切的通路有：脂质和动脉粥样硬化通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路等信号通路，结合丹栀逍遥散治疗干眼与抑郁的共同疾病靶点，绘制以下通路图（图7-9）。

图7 脂质和动脉粥样硬化通路

图8 HIF-1信号通路

图9 MAPK信号通路图

讨 论

“异病同治”理论是《黄帝内经》治病必求于本的体现，充分体现了辨证论治理论特点，其是指对于不同的疾病，如存在相同的病因、病机或病位，可采用相同的治疗法则，而着其中最关键的是不同的疾病在某一阶段表现出来的相同的证及其所包含的病机。张仲景《伤寒论》中也提到“观其脉证，知犯何逆，随证治之”，这“证”正是“异病同治”理论的核心。

中医认为肝郁化火可导致干眼和抑郁，中医称干眼为“白涩症”或“神水将枯”，《黄帝内经》云：“五脏化液……肝为液。”泪液的生成、运行有赖于肝之条达，如若肝失条达，肝气郁结而化火，则泪液亏少，眼失滋润濡养，发为干眼[7]。抑郁属于中医“郁证”的范畴，抑郁患者或受外界情志刺激、或脏腑功能失常、或气血阴阳失调，出现气机紊乱、情志不畅，可使肝气郁结、肝失疏泄，病变日久，肝气有余，壮火由生，火与郁相合，阳气郁遏于体内，火郁而生，且抑郁患者在长期服用抗抑郁药物后，药物助热伤津，火郁进一步加重，在此基础上祁明明等提出“火郁”是抑郁患者病情由轻转重的重要病机[8]。

干眼是由于多种病因引起泪膜的质、泪膜的量以及泪液动力学异常，从而导致泪膜不稳定，或可合并眼表损害，从而出现眼部不适和（或）视功能障碍的疾病。因地域和环境的不同，干眼的患病率存在一定的差异，我国干眼的患病率分布在6.1%～59.1%[9]。且在导致抑郁的眼部疾病中，干眼占比最高[10]。其主要原因在于多数干眼患者需要反复就诊治疗，对干眼降低了生活质量产生抱怨甚至悲观的想法，最终导致抑郁的发生。抑郁主要特征表现为与其环境不相符合的显著而持续的情绪低落，是由人们主观产生的。多项研究表明较正常人而言，干眼患者抑郁阳性的几率更高，且患者自觉干眼越严重，患抑郁的可能性越大且严重程度更大[11]。另有多项研究表明炎症反应、免疫反应、线粒体能量代谢异常、氧化应激、HPA功能失调等在抑郁症发病机制中起到重要作用[12]。干眼的发病机制主要与炎症反应、细胞凋亡、性激素失调、神经调节异常等有关[13]。

从西医与中医的角度均可看出干眼与抑郁可能存在相似的病理机制。本研究使用网络药理学的方法研究干眼与抑郁之间的蛋白、有效成分、基因和相关的生物过程，以阐明丹栀逍遥散“异病同治”干眼与抑郁潜在的机制。

1 丹栀逍遥散治疗干眼与抑郁的活性成分

通过对丹栀逍遥散成分—靶点网络，以及相关文献查阅，发现丹栀逍遥散治疗干眼-抑郁的关键成分是槲皮素（quercetin）、柚皮素（naringenin）、木犀草素（luteolin）、芦荟大黄素（aloe-emodin）、金合欢素（acacetin）、甘草查尔酮 A（licochalcone a）、山奈酚（kaempferol）等。槲皮素、山奈酚、木犀草素、金合欢素、甘草查尔酮A都是黄酮类化合物，大量研究表明黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎、抗血管生成、促凋亡和神经保护等多种药理活性[14]。

干眼与抑郁的发生伴随着细胞内的氧化应激的发生，而神经元对脂质（LD）毒性特别敏感，不能及时去除的LD的积累导致神经元过氧化加速，并引起神经变性，槲皮素、柚皮素与山奈酚均可减少过氧化的脂质在细胞内的沉积，进而抑制氧化应激[15，16]或减少细胞铁凋亡[17]，从而保护细胞。

干眼与抑郁的发生发展在一定程度上与机体内性激素水平相关，槲皮素、甘草查尔酮可调节雌激素受体活性[15，18]，山奈酚表现出雄激素样活性，能与雄激素受体的ASN705和TNR877残基结合，调节雄激素活性[19]，且其对细胞自噬有双向调节作用[20]。

炎症反应也是两者的共同发病机制，槲皮素与柚皮素均可阻断NK-kβ炎症通路，进而减轻炎症反应[15-16]，木犀草素可改变巨噬细胞M1（Inos，IL-1β，IL-6）/M2（Arg1，CD206，CD163，IL-10 和 IL-13）极化，通过p-STAT3的下调和p-STAT6的上调发挥抗炎作用[21]。全基因组转录组学分析表明，其可上调神经营养因子、多巴胺能、河马、和Wnt信号通路相关基因的表达，并下调p53、TNF、FOXO和Notch信号通路中的涉及的因子。并通过降低IL-6等炎症因子的水平进而减弱炎症反应，且可显著增加LPS诱导的抑郁小鼠下丘脑中的成熟BDNF，多巴胺和去甲肾上腺素[22]。甘草查尔酮A可通过抑制TLR4-MAPK和Txnip-NLRP3信号通路有效地缓解脂多糖诱导的炎症反应[23]。

芦荟大黄素是一种天然的蒽醌衍生物，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗寄生虫、神经保护、肝保护活性[24]，金合欢素是天然黄酮类的一种，其抗氧化损伤作用明显强于槲皮素、木犀草素等黄酮类化合物，其对视网膜急性损伤有明显保护作用[25]。

2 丹栀逍遥散治疗干眼与抑郁的作用机制

PPI网络分析中得到丹栀逍遥散治疗干眼-抑郁的主要靶点是 HIF1A、ESR1、EGFR、TP53、FOS、STAT3、MAPK3、STAT1、MAPK14、AKT1、MAPK1、CASP3等。HIF-1A是一种关键的转录因子，可迅速适应低氧环境，从而触发自噬，且在中枢及炎症细胞浸润区域同样会出现高表达，调节炎症、细胞凋亡、血管形成及诱导控制葡萄糖代谢[26]，研究表明在小鼠应激状态下，HIF-1A与TET1之间存在特异性相互作用，其化合物在Ddit4基因（抑郁相关基因）的表达发挥重要作用，HIF-1A与Ddit基因启动子区域的结合明显增多，Tet1介导的表观遗传调节可能有助于重度抑郁症连锁基因的调控[27]，STAT1和STAT3都是STAT蛋白成员，可通过JAK-STAT信号通路，在免疫、细胞分裂、细胞死亡等过程中发挥关键作用。Gałecka M等研究发现在抑郁患者中JAK3表达增加，STAT1表达降低，但是对于本通路的调节是否参与抑郁症的治疗还需要进一步确定[28]。STAT3被抑制后能够降低基质金属蛋白酶-3/9的表达，抑制角膜和结膜上皮细胞的凋亡，降低炎症因子如IL-1β、IL-6、IL-17A和IFN-γ的水平，进而减缓干眼的眼表损伤[29]，同时，其可调节重要信号通路如AKT/PI3K/mTOR和Ⅰ型干扰素通路等，进而改善神经炎症[30]，另有研究表示其抑制在神经系统损伤或神经变性后可起到保护或有害作用，机制尚不清晰，以治疗抑郁症[31]。王娇娇等通过针刺干眼模型兔发现泪腺中STAT3、JAK2 mRNA表达增加，且泪腺中炎症因子减少，表明JAK2/STAT3信号通路激活后的抗炎作用可能是治疗干眼关键通路之一[32]。

FOS是中枢神经元的代表物质，主要分布在下丘脑、海马体和丘脑，可能通过激活小胶质细胞进而导致抑郁症的发生及进展[33]；有研究表明慢性干眼引起的眼痛，中枢炎症反应可能发挥重要作用，FOS的mRNA水平较高[34]。

MAPK1、MAPK3、MAPK14可能是另一组关键蛋白，通过p38-MAPK信号通路或ERK信号通路作用参与机体神经递质的释放、激素的水平及炎症反应，进而影响干眼及抑郁进展[35]。海马体中磷酸化的p38 MAPK和裂解的CASP水平升高可能通过抑制细胞外信号相关激酶1/2的磷酸化，从而导致抑郁，且抑郁样行为与磷酸化的p38MAPK、裂解的CASP3呈正相关[36]。进而调控细胞凋亡。

GO富集分析发现丹栀逍遥散治疗干眼-抑郁主要与脂多糖反应、对氧化应激的反应、对异种生物刺激的反应、对金属离子及辐射的反应等生物过程相关；富集结果显示丹栀逍遥散可能通过多个生物过程来治疗干眼与抑郁，达到“异病同治”的效果。结合KEGG富集分析数据可以看出，丹栀逍遥散治疗干眼与抑郁主要涉及 TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路以及MAPK信号通路等信号通路；相关研究表明在抗抑郁治疗开始早期，TNF信号通路通过上调TNF/TNF受体超家族含量，发挥组织再生和神经发生减少，或可加速促炎进而治疗抑郁[37]；另有研究表明TNF下调可改善干眼患者的炎症[38]。与IL-17信号通路、HIF-1信号通路以及MAPK信号通路相应的各种关键蛋白中可以看出，三条信号通路主要参与机体内炎症反应、细胞凋亡及激素水平调控，进而治疗干眼与抑郁。

综上所诉，丹栀逍遥散的药物成分能够通过相同的通路作用于多个靶点，进而在其中发挥作用，如调控炎症反应、细胞凋亡、激素水平，甚至是参与神经递质的释放并保护神经，进而达到治疗目的，这也进一步说明干眼患者可能同样存在着神经损伤，抑郁患者可能同时存在干眼，或伴有更严重的干眼症状，同时本研究利用网络药理学对丹栀逍遥散治疗干眼、抑郁的有效成分、核心靶点、关键蛋白、信号通路和作用机制进行了论述，为丹栀逍遥散的后续临床研究提供了可靠的参考。