YAP蛋白在神经肌肉接头中作用机制的研究

杨滨瑞,赵琳琳,汪煜楠,初婷婷,郑永慧,张惊宇

(哈尔滨医科大学附属第四医院 神经内科,黑龙江 哈尔滨150001)

YAP(yes-associated protein,yes相关蛋白)是一种转录共激活因子,其本质为富脯氨酸磷蛋白,基因定位于人类染色体11q22区,是调节细胞生长发育通路的关键转录蛋白。近年相关文献表明YAP及其通路与多种疾病的发展密切相关。Xu等研究发现在阿尔茨海默病小鼠模型中YAP呈低表达并引起星形胶质细胞的早衰,而上述症状可被过度表达的CDK6部分改善[1]。以肌萎缩侧索硬化为模型,在探究导致该模型中神经元减少的原因时发现,YAP水平随着肌萎缩侧索硬化疾病进展而逐渐递减[2]。Watt等发现YAP与TEAD转录因子相互作用从而对骨骼肌质量产生促进作用[3]。YAP含量在运动神经损伤后提高并有利于神经源性肌肉萎缩的恢复。因此,激活YAP使肌肉体积缩小症状得以改善,以此为基础为治疗神经肌肉疾病提供了新的方向[3]。Gong等发现YAP在脑损伤的过程中对神经细胞具有保护作用,尤其在机体脑缺血损伤后的血脑屏障异常部分中尤为突出[4]。Ma等研究Hippo/YAP受ACTL6A调控并参与非小细胞肺癌的致病过程[5]。Zhu等发现miR-582-5p通过调控YAP/TAZ对非小细胞肺癌的进展产生影响[6]。Mia等探究心脏功能和结构在YAP低表达时得以正常维系[7]。Wang等探究弥漫大B细胞淋巴瘤与糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)的关系,发现GPNMB参与弥漫大B细胞淋巴瘤的发生机制是以YAP1为靶点对Wnt/β-catenin信号通路进行调控[8]。Lundin等通过有关实验发现造血干细胞的表达需要YAP的参与[9]。Ai等发现YAP通过调节白血病抑制因子进而影响星形胶质细胞的成熟[10]。Salloum等在探究肝纤维化进程中游离脂肪酸与YAP的关系时发现肝纤维化的程度因脂肪酸激活YAP而加重,p38 MAPK参与此过程的调控[11]。Ou等研究发现ROCK1拮抗剂改善肠道纤维化的机制与YAP/TAZ的靶向抑制有关[12]。Ortillon等发现通过拮抗YAP的表达将有利于改善高糖对血管的不利影响[13]。心肌在高血糖时损伤且该过程受肾素受体调控,途径为肾素受体-AMPK-YAP[14]。目前,YAP与神经-肌肉接头疾病的联系研究相对较少。

神经-肌肉接头疾病是指神经-肌肉接头间传递功能障碍所引起的疾病,主要包括重症肌无力和Lambert-Eaton肌无力综合征等[15-17]。既往研究表明agrin作为一种聚集蛋白,可以调控突触后膜的乙酰胆碱。Chakraborty等研究agrin调控YAP表达关系时发现,agrin通过整合素聚焦黏附和Lrp4/MuSK受体介导的信号通路转导基质和细胞刚性信号,从而增强YAP的稳定性和机械活性,同时agrin通过YAP依赖的转录可以诱导或增加肿瘤发生概率,证明agrin在细胞外基质具有调节YAP表达的作用[18]。本研究通过在分化后的C2C12肌管中用AAV8表达shRNA敲低YAP,发现AChR聚集受到抑制,说明YAP可以独立于肌管形成而调节NMJ形成。同时在实验中还发现agrin信号通路可以减弱YAP磷酸化,促进YAP进入细胞核从而发挥转录功能,提供了更深入的机制研究,为相关疾病治疗提供分子层面的指导意义。

1 材料与方法

1.1 主要材料C2C12细胞,HEK293细胞,pAV-U6-GFP,Helper质粒,pll3.1质粒,agrin。

1.2 C2C12细胞培养选择含量为20%、1%的幼牛澳洲血清和胚胎鸡萃取物作为培养基DMEM的基质原料,当细胞增殖融合程度为80%时,将培养基质更换为马血清(4%)的进行细胞引诱分化,时间为4天整,并每24 h观察1次。

1.3 AAV8包装纯化将编码scramble shRNA的质粒与Rep/Cap和Helper质粒一起转染HEK293细胞获得AAV8。细胞转染后3天汇集裂解液与培养基。经5次冻融循环和Benzonase处理后,培养基和裂解液组分混合物在4℃以转速68 000 rpm进行碘克沙醇梯度离心2 h。Amicon 15-100000 MWCO过滤器对40%梯度进行提取浓缩,并通过qPCR进行定量。

1.4 C2C12细胞免疫荧光染色对细胞固定时应添加4%的多聚甲醛(PFA)过夜。PBS溶液冲刷样本0.5 h。25℃环境中,配比(5%BSA,2%TritonX-100,5%山羊血清PBS)浸泡细胞120 min,后12 h另加一抗与封闭缓冲液(环境温度为4℃),再选用TritonX-100的PBS液(浓度2%),冲洗样本60 min,次数为3次。在荧光二抗的参与下进行时长为60 min的室温孵育,之后进行3次PBS冲洗,每次1 h且该过程使用的PBS应含有2%TritonX-100。再染试剂选用DAPI。用防荧光淬灭封片剂安装样品,并用盖玻片覆盖。用蔡司共聚焦激光扫描显微镜收集Z系列图像,并折叠成单张图像。

1.5 Western blot和免疫共沉淀细胞裂解获得裂解产物。通过SDS-PAGE电泳凝胶后,硝酸纤维素膜承载其分解产物。选用含有5%脱脂牛奶PBS封闭液处理样本60 min,环境温度4℃,同时加入一抗,培育12 h。之后进行次数为3次的洗涤,该过程所需的试剂为PBS且其含有0.1% Tween 20。再与室温25℃的环境下,用酶标二抗培育样本1 h,反复3次洗涤,再用印迹蛋白ECL成像系统,成像曝光。免疫沉淀试验用上述裂解缓冲液在无SDS的情况下裂解细胞,用1～2 μg抗体孵育过夜。然后样品与10 μl蛋白A/G在4℃下孵育5 h,将相关蛋白分解进行Western blot。

1.6 质粒构建和细胞转染在下面网站中输入鼠YAP核酸编码序列设计shRNA:https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do,Target Design Options,将shRNA序列包含茎环和BamHI,HindIII酶切位点5’-GATCC GGAAG CGCTG AGTTC CGAAA TTGTG CTTAT TTCGG AACTC AGCGC TTCCT TTTTA-3’克隆至pAV-U6-GFP载体上。表达鼠YAP蛋白质粒则是以pll3.1质粒为模板,将C端带有Flag标签的鼠YAP蛋白的基因编码序列克隆至CMV启动子后。质粒-细胞转染时通过根据相关理论调研,选择HEK293细胞进行前期培养,当细胞生长至50%～60%程度时,将质粒(5 μg)与PEI(1 mg/ml)(10 μl)共同混合摇匀,同时将DMEM培养基(200 μl)加入,培养细胞15 min,将以上的混匀物加入皿(35 cm)的HEK293细胞,进行12 h的培养,培养后再更换培养基。

1.7 统计学分析选用SPSS25.0,进行数据统计学分析,组间显著性差异分析选非配对t检验和单因素方差分析。P<0.05时,为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YAP敲低shRNA的构建

与scramble shRNA组相比,YAP水平在shYAP组中明显下降78%,证实YAP shRNA敲低效率的同时说明其构建成功(图1)。

图1 YAPshRNA构建的成果

2.2 肌管形成后敲低YAP抑制乙酰胆碱受体(AChR)聚集

在YAP敲低后AChR的长度和荧光强度都下降了约50%,肌管形成已经完成后YAP功能的缺失会妨碍AChR的聚集,抑制神经肌肉接头的形成(图2)。

图2 肌管形成后YAP敲低的AChR聚集受损

2.3 agrin促进C2C12肌管中的YAP进入细胞核

免疫荧光染色发现agrin加入1 h后就有较多的YAP进入细胞核并于3 h后达到最高,即75.4%的细胞核中有YAP,而且YAP进入细胞核要早于AChR的聚集(图3)。

图3 Agrin处理增强C2C12肌管中YAP核定位

2.4 agrin减弱YAP蛋白S127位的磷酸化

agrin处理后YAP磷酸化水平下降直至12 h,YAP-β-catenin结合升高之后下降,说明YAP对于突触前后的调节有不同的机制(图4)。

图4 通过agrin处理降低YAP磷酸化

3 讨论

本实验研究发现agrin通过减弱YAP蛋白磷酸化使YAP进入细胞核发生转录进而导致乙酰胆碱受体聚集从而有利于神经肌肉接头间信号的传递。神经-肌肉接头间生理信息传导障碍会导致神经-肌肉接头疾病。目前已有研究者将谷氨酸能神经-肌肉接头(果蝇)认作一种经典实验模型用来对突触相关活动的机制进行研究。部分学者认为氨基酸转运体JhI-21及c-AMP对谷氨酸受体具有调控作用。前期文献研究提供了一种假设即某一蛋白或许具有这样的作用,通过聚集或抑制突触受体进而影响神经-肌肉接头的形成。当兴奋传递至突触前膜时,ACh在Ca2+的辅助下,通过间隙到达突触后膜并与其上的受体结合完成信号传递。基于上述,实验中通过对YAP敲低后AChR的长度和荧光强度进行检测,显示出敲低YAP可以引起乙酰胆碱受体聚集减少,后续可以继续探究与神经-肌肉接头形成相关的其他物质,进一步在其他层面进行多方面验证。

通过近十年对NMJ的相关实验研究,已形成苍蝇和隐杆秀丽线虫中NMJ的形成与Wnt信号具有关联性的共识。NMJ在哺乳动物中的形成是否具有相同调节方式,对此尚无明确结论,部分学者提出Wnt通路成员与AChR的表达存在某种程度的相关性这一观点,Wnt4和Wnt11的表达可以增加AChR的集中和运动神经细胞的增殖从而促进哺乳动物神经肌肉接头的活性[19]。Wnt3a通过下调AChR聚集和稳定所必需的Rapsyn蛋白进而拮抗AChR的聚集[20]。以上研究证明哺乳动物NMJ的形成过程有Wnt信号参与,但其具体的作用机制仍不明确。Hippo信号通路和Wnt信号通路存在重合点。Wnt通路受到Hippo通路影响的原因是后者导致自由细胞质β-catenin低表达,在此情况下出现细胞周期停滞[21]。综上所述,Wnt信号通路与Hippo信号通路存在交叉并参与NMJ的形成过程,因此推断激动Hippo通路基因转录翻译能力的YAP对NMJ的形成可能具有一定的调节作用。以上推理论断均与本实验中YAP的作用存在一致性。接下来可以进行相关的细胞和动物实验,进一步验证本实验的结果。

NMJ目前已成为经典的神经-化学突触模型,近几年来,对NMJ的构成及其作用原理等进行的研究已经逐渐深入。本实验从YAP是否可以独立对NMJ进行调控角度出发,利用细胞免疫荧光染色,Western blot等方法,对NMJ调控机制进行研究,在研究过程中发现agrin信号通路可以减弱YAP磷酸化,促进YAP进入细胞核进而对突触后 AChR 进行表达调控。目前对于 YAP 影响NMJ形成机制的研究仍处于萌芽阶段。未来需要进行更多的相关研究,提供更多的有效数据。