Skp2及p27kip1在原发性胃癌组织的表达及对胃癌细胞增殖、凋亡的影响

张永健,郭学海*,高秀凤,王 斌,赵宏阳

(1.开滦总医院林西医院 普外科,河北 开滦063103;2.开滦总医院林西医院 消化内科,河北 开滦063103)

原发性胃癌是起源于胃黏膜的癌症,是临床常见的恶性肿瘤,尽管其发病率逐渐下降,胃癌仍然是全世界癌症相关死亡的最常见原因之一[1]。幽门螺杆菌感染是胃癌的主要危险因素,新分子有助于胃癌的诊断和降低死亡率,大多数被充分研究的分子是由胃上皮表达的组织蛋白生物标记物,与细胞周期调控和细胞凋亡调控相关[2-3]。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,SKP2)是细胞周期蛋白A-CDK2 S期激酶的基本成分[4],它主要在S期特异性识别磷酸化细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制物(Cyclin dependent protein kinase inhibitor,p27kip1)[5],并参与了多种癌症的发生发展和细胞凋亡调控,是肿瘤治疗的新靶点[6-7]。研究表明Skp2和Slug在侵袭性前列腺癌中共表达,并受到去甲酰化阻滞的抑制,在前列腺癌细胞的凋亡中发挥调控作用[8],Skp2蛋白在宫颈癌组织中的表达率高于癌旁组织,其表达与临床分期、恶性程度、淋巴结转移、血管浸润和间质浸润呈正相关[9],也有研究通过小鼠实验证实SKP2和p27Kip1可以通过靶向MEK/ERK途径增强CDK4/6抑制剂的细胞抑制作用[10],但Skp2和p27Kip1在原发性胃癌中的表达和对胃癌细胞增殖凋亡的作用尚不清晰,因此本研究入组临床原发性胃癌患者,分析癌组织和癌旁组织中Skp2和p27Kip1的表达水平,并通过细胞学实验探究Skp2和p27Kip1对胃癌细胞增殖、存活、早期凋亡和晚期凋亡的作用,为Skp2和p27Kip1在原发性胃癌中发挥的作用提供分子机制和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2018年12月至2021年12月开滦总医院林西医院资料完整并经临床、病理证实的原发性胃癌患者63例,获取患者癌组织和癌旁组织。本实验中所有患者均签署知情同意书并通过开滦总医院林西医院伦理委员会审核。

人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 主要试剂及仪器

RPMI-1640培养基,胎牛血清FBS和青链霉素购于购于美国Gibico公司;T25细胞培养瓶、离心管等实验耗材购于美国Corning公司;NC质粒和si-Skp2质粒购于广州Ribobio公司;Skp2和p27Kip1引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成。lipofectamine3000(货号: L3000015)购于美国invitrigen 公司,Cell Counting Kit-8(CCK8,货号Cat.No.:HY-K0301)细胞增殖及毒性检测试剂盒购于美国MCE公司;细胞凋亡试剂盒7-ADD/Annexin V(货号:KGA)购于南京凯基生物公司,qPCR仪购于美国ABI公司,FACSVia流式细胞仪购于美国BD公司,PTC-3500全波长酶标仪购于北京普天新桥技术有限,Western blot电泳仪购于美国bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1qPCR检测胃癌组织和胃癌旁组织中Skp2和p27Kip1mRNA表达

对癌组织和癌旁组织在液氮中进行研磨,采用Trizol、Titan One Tube RT-PCR和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR试剂盒进行总mRNA提取、逆转录并进行Skp2和p27Kip1的表达水平的qPCR,所有操作避免RNA酶污染。使用ABI 7500系统进行实时荧光定量PCR,预变性95 ℃ 10 min,变性95 ℃ 10 s,退火60 ℃25 s,延伸72 ℃ 205 s,38个循环, Skp2、p27Kip1和GAPDH引物序列见表1,使用GAPDH作为内参,以2-△△Ct计算Skp2和p27Kip1相对表达量。

表1 qPCR检测中不同基因的引物序列

1.3.2细胞培养及转染条件

SGC-7901培养条件:RPIM1640培养液(内含10%胎牛血清、青霉素100 μg/ml、链霉素100 μg/ml),置CO2培养箱内,5%CO2,37℃静置培养;细胞转染:用胰酶消化细胞后重选,严格按照转染试剂盒lipo3000说明将NC和Skp2质粒进行转染,转染6～8 h后更换成完全培养基重新加入完全培养基,置于5%CO2培养箱中37℃培养,48 h后用于各组实验。

1.3.3CCK8法检测人胃癌细胞SGC-7901细胞活力

以CCK-8测定细胞活力,严格按照CCK8试剂盒说明进行操作,将细胞转染质粒后以2×103的密度接种到96孔板中,分别在37℃下培养24 h、48 h和72 h,向每孔加入10 μl CCK-8 溶液(此过程避免孔中生成气泡以避免影响OD值的读数),将培养板在培养箱内孵育1～4 h,用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。

1.3.4细胞凋亡实验

将生长对数期的SGC-7901细胞胰酶消化后收集全部细胞,PBS缓冲液重悬细胞,严格按照细胞凋亡7-ADD/annexin V试剂盒进行凋亡实验,避光孵育20 min,PBS清洗1遍,200 μl PBS重悬细胞,流式细胞仪进行细胞凋亡分析,所有操作均在冰上避光完成,各组实验重复3次。

1.3.5Western blot 检测蛋白表达

将各组状态良好的SGC-7901细胞1 ml RIPA蛋白裂解液冰上提取细胞总蛋白,使用BCA法测定蛋白浓度。加入5×SDS的蛋白上样缓冲液煮沸后备用。将样品分别加入不同的泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶电压和分离胶电压分别为80V 10 min,120V 1.5 h,后转至PVDF膜,用5%BSA封闭。加入特异性一抗Anti-SKP2 antibody(1∶200,ab183039,abcam,英国),Anti-p27 KIP 1 antibody(1∶5 000,ab32034,abcam,英国)和GAPDH(1∶10 000,ab8245,abcam,英国)于4℃冰箱过夜。TBST洗膜3次,每次10 min,加入特异性的羊抗兔二抗(1∶2 000),孵育1 h。TBST洗膜3次,每次10 min,采用ECL化学发光液曝光显影,使用Photoshop图像分析软件系统进行半定量分析。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

本研究共入组胃癌患者63例,平均年龄57.45±6.31岁,患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),临床一般资料详见表2。

表2 63例患者一般临床资料的比较

2.2 Skp2和p27Kip1在癌组织和癌旁组织中mRNA的表达比较

通过qPCR法检测癌组织和癌旁组织Skp2和p27Kip1mRNA表达水平,结果如图1所示,与癌旁组织相比,癌组织中Skp2mRNA表达水平显著升高,p27Kip1mRNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 Skp2和p27Kip1在胃癌组织和癌旁组织中mRNA的表达比较

2.3 si-Skp2对人胃癌细胞SGC-7901细胞活力的影响

通过CCK8实验分析si-Skp2对人胃癌细胞SGC-7901活力的影响,结果表明与对照组相比,si-Skp2组胃癌细胞SGC-7901细胞活力出现显著下降,具体表现为24 h、48 h、72 h的吸光度分别显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),见表3。

表3 Skp2和p27Kip1对人胃癌细胞SGC-7901细胞活力的影响

2.4 si-Skp2对人胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响

通过流式细胞实验分析si-Skp2对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响,如图2,结果表明与对照组相比,si-Skp2组细胞存活显著降低、细胞晚期凋亡显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),而细胞早期凋亡没有统计学意义(P>0.05)。

图2 Skp2和p27Kip1对人胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响

2.5 si-Skp2对p27Kip1蛋白表达的影响

如图3通过Western blot 检测各组细胞Skp2和p27Kip1蛋白变化,结果表明与对照组相比,si-Skp2组Skp2蛋白表达水平显著降低,p27Kip1蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。

图3 si-Skp2对p27Kip1蛋白表达的影响

3 讨论

原发性胃癌一般起源于胃黏膜细胞,由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因,胃癌呈现年轻化倾向[11]。胃癌可发生于胃的任何部位,其中半数以上发生于胃窦部,胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌,早期无明显症状,最主要的症状即为腹痛,其预后不良并伴有转移,是导致癌症死亡的主要原因[12]。不同患者的肿瘤特征不同,不同的患者存在不同的肿瘤微环境[13]。有研究证实原发性胃癌中伴随着多种基因的调控,通过对临床全基因组RNA-seq数据分析证实原发性胃癌患者肿瘤内具有异质性,多种细胞周期调控和细胞凋亡调控基因如Skp2、ERBB2、CLDN11和CDK12发挥重要作用[14]。有研究根据Kaplan-Meier生存分析和Cox比例风险回归分析证实胃癌患者中细胞的增殖、细胞周期G1/S转换与患者的不良预后相关[15]。Skp2是一种能与S期激酶cyclinA-CDKI相互作用的蛋白,Skp2的表达水平在G0/G1 期降低,在S期表达增加[16]。Skp2的表达受转录及转录后水平双重调节,与在不同类型的细胞中起主导作用的调节机制不同,Skp2能特异性识别磷酸化底物并介导其泛素化降解,调节p27Kip1等细胞周期调控因子[17]。本研究通过qPCR证实在不同病理分期、不同转移程度、不同年龄的患者中,均出现了显著的Skp2 高表达,而p27Kip1显著低表达的现象,这提示出Skp2 和 p27Kip1在胃癌进展中可能发挥重要作用,并且在不同类型的胃癌患者中具有普遍性,有望成为的胃癌早期诊断分子标志物。

细胞增殖和细胞凋亡是生命的基本现象,可以维持体内细胞数量动态平衡。在胚胎的发育、机体衰老和病变的细胞中发挥调控作用,保证了机体的健康。细胞增殖和细胞凋亡受多种基因调控[18-19],细胞的异常增殖和凋亡失控会引发癌症等疾病,研究表明Skp2在许多人类癌症中也过度表达,Skp2可以靶向磷酸化p27进行蛋白酶体降解,对多种细胞生长、凋亡发挥直接调控作用,因此Skp2被认为是癌基因和重要的药物靶点[20]。本研究通过细胞学实验证实敲除Skp2后,胃癌细胞的增殖能力显著降低,细胞存活显著降低,细胞晚期凋亡比例显著增加,Western blot 结果证实敲除Skp2后,胃癌细胞的P27Kip表达显著上升,由此可见skp2可通过p21Kip1对胃癌细胞的增殖和凋亡发挥调控作用。

综上,本研究证实在原发性胃癌患者中Skp2高表达、p21Kip1低表达,有望作为早期诊断的生物标志物,并且Skp2可以通过p27Kip1抑制人胃癌细胞活性,降低细胞的增殖能力,诱导胃癌细胞晚期凋亡。本研究可以进一步扩大临床样本量,通过ROC曲线等分析,Skp2和p27Kip1可以作为早期诊断或者预测胃癌患者的生物学标志物,为临床诊断和治疗提供新思路。