应用质谱法和显色培养法对真菌血流感染鉴定的比对研究

宋伶俐,李密阳,马琳琳*

(1.北华大学附属医院 检验科,吉林 吉林132011;2.吉林大学中日联谊医院 检验科,吉林 长春133033)

近年来,随着激素、广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用,真菌引起的血流感染日渐增多。念珠菌是真菌血流感染最常见的病原菌,并且真菌感染比细菌感染死亡率更高,治疗效果也相对更差[1]。为了降低血流感染的发病率和死亡率,早期有针对性的抗菌药物治疗是关键,故临床对真菌的快速准确鉴定成为目前迫切解决的问题。最近几年病毒感染继发肺部感染入住重症监护病房(ICU)的患者,进而继发性合并真菌性败血症也有所增加,这种继发感染导致了预后不良和病死率的增加。另有研究显示,致病真菌的种类也有所增加,故临床对真菌引起的血流感染的快速诊断至关重要[2]。

临床实验室的微生物鉴定依赖于传统生化反应和基因测序技术等,特点是耗时长或成本高。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)的发展,引入了一种快速简单高效成本低的方法,改变了微生物的常规鉴定方法[3]。质谱法(VITEK MS)是基于MALDI-TOF技术,用于临床分离的细菌、酵母样真菌、丝状真菌等的快速鉴定。本研究将血培养报阳后采用培养后质谱法、分离胶处理后质谱法,培养后显色法和直接显色法,4种方法进行鉴定并进行对比研究,评价了这些方法在临床应用中的价值,为临床真菌鉴定选取合适方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2022年1月至2022年6月北华大学附属医院无菌部位培养的念珠菌共150株。包括白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、新生隐球菌。菌株为ITS测序确认菌株。真菌血流感染采用建模方式进行实验。

1.2 试剂和仪器

全自动血培养仪(美国BD公司);含树脂需氧血培养瓶(美国BD公司);甲酸、乙腈(法国梅里埃);血琼脂平板和沙保弱琼脂平板(郑州安图);Vitek MS质谱仪(法国梅里埃);分离胶促凝管(INSEPACK)。

1.3 标准菌株

白色念珠菌ATCC14053,近平滑念珠菌ATCC22019。

1.4 真菌建模方法

将白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等配制成0.5 麦氏浓度的菌液,取菌液1 ml注入到需氧培养瓶中,取8 ml羊血注入瓶中,放入血培养仪中进行增菌培养,仪器报阳后用相应方法进行鉴定。

1.5 血培养常规鉴定

血培养瓶报阳后采用分离胶处理方法进行质谱鉴定,记录结果;转种沙氏培养基培养孵育18～24 h后质谱鉴定,记录结果;转种显色培养基常规培养,培养孵育18～24 h后,记录显色培养基的结果;转种沙氏培养基养孵育18～24 h,培养后菌落再进行显色培养18～24 h后,记录显色结果。

1.6 分离胶促凝管预处理血培养瓶直接质谱鉴定[4]

1.6.1血培养瓶内容物,抽取5 ml至普通分离胶促凝管,900 r/min水平室温离心10 min,弃去上清,见分离胶表层灰白色菌体富集物。

1.6.2500 μl无菌注射用水,加入1.5 ml离心管中备用,挑取上述灰白色菌体富集物,加入500 μl无菌水中,12 000 r/min,离心2 min,用无菌枪头吸取上清弃去,加入500 μl无菌水悬浮并充分振荡混匀,12 000 r/min,离心2 min,留沉淀重复洗涤步骤1次。

1.6.3取1份菌体富集物,弃去上清,加入500 μl 75%乙醇(依菌量定)悬浮并振荡混匀,12 000 r/min,离心2 min。

1.6.4用移液器将上清(乙醇)吸取并弃去,12 000 r/min,离心2 min。

1.6.5室温开盖放置数分钟晾干去除乙醇(残留乙醇会影响质谱峰,尽量完全干燥),向晾干的离心管中加入20 μl 30%甲酸(依菌量而定)振荡混匀,再加入等量乙腈,12 000 r/min,离心2 min。

1.6.6取离心后的上清液1 μl点至靶板并室温晾干,待样本干燥后加入1 μl基质液,进行质谱检测。

1.7 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析。统计分析采用χ2检验、Fisher确切概率检验或非参数检验,以P<0.05有差异有统计学意义。

2 结果

2.1 显色培养鉴定结果

血培养瓶报阳后,直接用显色培养基转种培养和用沙氏培养基转种后再显色鉴定,得出的结果是一致的。显色培养基仅能鉴定4种常见念珠菌,故实验中选用的20株不常见真菌无法给出鉴定结果,显色鉴定与基因测序结果一致的共有101株,鉴定准确率为77.69%(101/130)。显色结果与基因测序结果不一致发生率最高的是热带念珠菌,有12株与基因测序不同,达48%(12/25),其次依次是克柔念珠菌30%(3/10)、白色念珠菌15.56%(7/45)、光滑念珠菌14%(7/50)。

近平滑念珠菌在显色培养中有7例显色为紫色,误认为是光滑念珠菌,3株无色无法鉴定;葡萄牙念珠菌有4株显紫色,误认为是光滑念珠菌,2株无色无法鉴定;白色念珠菌与热带念珠菌也可显紫色,共14株误认为光滑念珠菌。新生隐球菌显白色无法鉴定。见表1。

表1 培养后显色和直接显色结果(株)

2.2 质谱鉴定结果

血培养瓶报阳后,转种沙氏培养基培养后质谱,与基因测序的一致率是96.6%(145/150),有5株质谱没有给出鉴定结果。采用分离胶直接质谱仅鉴定出7株真菌,与基因测序的一致率为4.67%(7/150)。1株光滑念珠菌错误的鉴定为挪威毕赤酵母菌、1株克柔念珠菌无法鉴定;2株葡萄牙念珠菌有1株鉴定为酿酒酵母菌、1株无法鉴定;1株新生隐球菌无法鉴定。分离胶直接质谱鉴定有143株无法鉴定无结果,原因主要为所得质谱谱峰不够。见表2。

表2 培养后质谱和分离胶后质谱结果(株)

2.3 显色鉴定与质谱鉴定比较

分离胶直接质谱其鉴定效率最高,出结果用时最短,但准确率最低。培养后质谱鉴定用时和直接显色鉴定用时相同,但准确率存在差异,并且P<0.05,差异有统计学意义。培养后显色鉴定与直接显色培养鉴定一致,准确率无差异,但用时直接显色鉴定要提前24 h。另外显色鉴定无法给出少见菌和不典型显色的菌株的鉴定结果。故4种方法比较,兼顾时间和准确率最优的方法为培养后质谱鉴定。见表3。

表3 鉴定结果所用时间、准确率比较

3 讨论

全球流行的深部真菌感染,尤其是血流感染,以念珠菌为主,病死率非常高,ICU住院患者,病死率可高达40%[5]。新生隐球菌也是血流感染可见病原体之一[6]。病毒感染、激素、免疫抑制剂的使用也增加了ICU病人的感染风险。近期报道的阿萨西毛孢子菌引起的血流感染病死率可高达86%,其他真菌从45%～90%不等,病毒感染的病人,自身微生态失调,增加了微生物易位的风险,可能为病原体的主要来源[7]。真菌感染的高死亡率决定着其早期诊断的重要性,真菌血流感染诊断的现状远远无法满足临床对于血流感染早期诊断的需求。而快速准确的识别病原菌并且正确初始的抗生素治疗,对于脓毒血症尤为重要,早期适当的接受抗生素治疗的患者可以降低死亡率并改善临床预后。目前临床上血培养仍然是诊断血流感染的金标准[8]。临床微生物实验室真菌鉴定方式主要有显色鉴定、手工鉴定、质谱鉴定、仪器鉴定、分子生物学鉴定等方式,其中全自动微生物分析系统和显色鉴定为主要方法,有报道比较了质谱和全自动微生物分析系统真菌鉴定的一致性达80%[9],比较了手工鉴定和显色鉴定的准确率[10]。本研究比较了质谱技术和显色鉴定的一致性和准确率,对真菌血流感染报阳后直接显色鉴定和分离胶处理后质谱鉴定进行了研究,结果表明,质谱鉴定优于显色鉴定,血培养报阳后经分离胶处理直接质谱鉴定的准确率还有待提高。

从本研究的结果可以看出,如果是无菌部位的真菌感染,尤其是血流感染,建议准确鉴定到种,不建议采用显色方法,因显色方法的准确率仅为77.69%,显色中的错误发生率最高的是热带念珠菌。其次依次是克柔念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌,有很多其他念珠菌容易被错误鉴定为光滑念珠菌。但值得注意的是显色培养后的菌落并不影响质谱鉴定的准确性[11]。采用培养后质谱鉴定,对于酵母样真菌的准确率达96.6%,相比全自动微生物分析系统,质谱更加快速准确,可提前24 h,对于罕见菌和少见真菌的鉴定准确率也更高[12]。

本研究对血流感染报阳后分离胶处理后直接鉴定对真菌鉴定提供了新思路,此方法1 h就可以鉴定出结果,但是准确率太低,多数都无法鉴定出结果,原因为无法获得谱峰,这可能由于真菌报阳后不能达到质谱所需菌量或者由于富集方法无法大量集菌,也可能由于真菌细胞壁较厚,破壁技术不够完善,后续方法有待改进,可尝试短时固相/液相培养方法进行改进[13],值得后续继续研究。另外,血流感染后直接显色鉴定培养与培养后显色鉴定,其结果是一致的,对于没有质谱技术的医院,为缩短鉴定时间不失为一种新思路,但由于显色鉴定的准确率不高,所以后续仍需用可靠方法鉴定到种,但可以为临床提供初步诊断的证据,作为一种基础初步替代方法在缩短鉴定时间上也行之有效。

综上所述,培养后质谱鉴定法在时间和准确性上为较优方法,对于血流感染以及深部感染的真菌,可采用此方法,可为临床的早期诊断提供依据。血流感染报阳性后经分离胶处理后利用质谱技术直接进行鉴定,此方法还有待进一步研究,以便能够为临床提供更加快速的可靠的鉴定方法。