RhD阴性孕妇DEL型的筛查及基因型分析

韩 雪,韩红梅,李 捷

(天津市第五中心医院 输血科,天津300450)

在人类红细胞血型系统中,Rh血型系统的重要性仅次于ABO血型系统。D抗原在Rh血型抗原中免疫原性最强,抗-D可引起新生儿溶血病以及严重溶血性输血反应。D抗原存在多种变异体,包括部分D型(partial D)、弱D(week D)型、DEL型等。其中DEL型红细胞膜上的D抗原表位数目较少,临床上常规的血清学方法检测通常判读为阴性,需采用敏感的吸收放散试验检出。目前已有RhD阴性孕妇被DEL型胎儿红细胞免疫和RhD阴性个体输注DEL型血液,而产生抗体的报道[1]。本研究旨在对天津滨海新区RhD初筛阴性的孕妇进行DEL型基因分析,结合血清型抗原检测和不规则抗体筛查,为DEL型孕妇提供合理的产前监测计划。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集天津市第五中心医院产科就诊的RhD阴性围产期妇女标本102例,年龄范围20～39岁,平均年龄(28.72±7.65)岁,留取EDTA-K2抗凝全血约5 ml备用。纳入标准:产前RhD检测结果为阴性且均为单胎妊娠。排除标准:①异位妊娠者;②孕期合并有子宫内膜疾病、既往有血液、免疫系统疾病史的患者或临床资料不完整者。本研究获得医院伦理委员会批准认可。

1.2 仪器与试剂

TD-3A型血型血清学离心机(长春博讯科研仪器有限责任公司)移液器(Eppendrof公司)。核酸提取或纯化试剂盒(天津秀鹏生物技术开发有限公司,生产批号201808001);人类红细胞RHD基因分型试剂盒(PCR-SSP法)(天津秀鹏生物技术开发有限公司,生产批号201810002);琼脂糖(Biowest)EB染料(天津秀鹏生物技术开发有限公司,生产批号201703001);高速离心机(SIGMA SIGMA1-14);JY300C电泳仪(北京君意东方电泳有限公司);PCR扩增仪(美国应用生物系统(ABI)公司9700型);GenoSens1860凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)。ABO、RhD血型定型检测卡(单克隆抗体)(生产批号20161204,20171204,20181204,长春博讯生物技术有限公司);ABO正反定型及RhD血型定型试剂卡(柱凝集法)(生产批号ABR261A,ABR268A,奥森多医疗器械贸易(中国)有限公司);RhD(IgG)血型定型试剂(单克隆抗体)(生产批号20181809,上海血液生物);Rh血型抗原检测卡(单克隆抗体)(生产批号20160601,20170601,20180601,长春博讯生物技术有限公司);抗人球蛋白微柱凝胶检测卡(生产批号20161103,长春博讯生物技术有限公司);抗筛细胞(生产批号45330.19.1,美国伯乐);酸放散液(广州展全公司、生产批号:20170101)。

1.3 方法

1.3.1RhD阴性血清学确认检测 ①试管法:取不同批号的IgM、IgG抗-D2滴与3%～5%待检红细胞悬液50 μl混匀,37℃水浴60 min,再以大量生理盐水洗涤3次,弃去上清液,加入抗球蛋白试剂2滴混匀,1 000 g离心15 s,不凝集即确定为RhD阴性。②微柱凝胶法:取RhD血型检测卡,加入0.8%～1%待检悬浮红细胞标本50 μl混匀,置专用离心机214 g离心5 min后取出,观察不凝集即判定为RhD阴性。

1.3.2放散D(DEL型)检测方法 生理盐水洗涤待检红细胞3次,取1 ml红细胞标本与IgG抗D混匀,37℃水浴60 min进行吸收实验,然后进行酸放散,如吸收放散试验阳性时表明为DEL型。

1.3.3Rh抗原血清学检测 Rh血型抗原检测卡每孔加入1%待检红细胞悬液50 μl,离心后,根据待检红细胞与检测卡RhC、c、D、E、e单克隆抗体反应格局,判读Rh血型表型结果。

1.3.4基因组DNA的提取 严格按照天津秀鹏生物技术开发有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒说明书操作,提取104例经抗人球蛋白法确定为RhD阴性的样本提取基因组DNA备用。DNA产物应该保存在-20℃,以防NDA降解。

1.3.5PCR检测 根据《人类红细胞RhD基因分型试剂盒(PCR-SSP法)》说明书,在ABI9700扩增仪上进行试验操作,操作步骤如下:将80 μl dNTP-Buffer工作液、0.8 μl Taq酶和10 μl DNA总共90.8 μl混合液漩涡混匀并瞬时离心;向每个引物孔(1～8孔)各加入10 μl上述混合液。PCR循环参数为96℃ 2 min,1个循环;96℃ 20 s,68℃ 60 s,5个循环;96℃ 20 s,65℃ 50 s,72℃ 45 s,10个循环;96℃ 20 s,62℃ 50 s,72℃ 45 s,18个循环;72℃ 5 min,1个循环。将PCR产物移至2.5%琼脂糖凝胶电泳孔中,电泳参数设置为140-150V电泳15～20 min,电泳后紫外光下成像仪拍照记录及分析。根据提供的结果分型表(表1)解释分型结果。

表1 RHD基因分型结果判断标准

2 结果

2.1 血清学确认试验经检测102例标本均鉴定为RhD阴性,吸收放散试验结果显示15例DEL表现型(占14.7%)。

2.2 不规则抗体筛查检出9例阳性,其抗体为抗-D,基因分型均为RhD全缺失型。15例DEL型孕妇均未检测到抗-D抗体。孕妇血清抗-D抗体与妊娠或生产的关系,见表2。

表2 孕妇血清抗-D抗体与妊娠或生产的关系

2.3 Rh血型系统抗原检测102份阴性标本均未发现CCEe、CcEE 及CCEE表型(表3)。

表3 RhD初筛阴性孕产妇标本Rh血型系统分型结果

2.4 102例RhD阴性围产期妇女标本RHD基因分型RHD基因全缺失型70例,占全部阴性标本的68.6%;DEL RHD 1227A型标本15例,占全部阴性标本的14.7%,其中纯合型13例,杂合型2例;RHD-CE(2-9)-D标本10例,占全部阴性标本的9.8%;弱D15型标本5例,占全部阴性标本的4.9%;另外有2例不能用此PCR-SSP试剂盒确定其基因型,占全部标本的2%,见图1～6,表4。图1-6为RHD基因分型PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的条带格局。

图1 RHD基因全缺失型 图2 DEL RHD1227A纯合型

图3 RHD-CE(2-9)-D型 图4 弱D15型

图5 DEL RHD1227A杂合型 图6 不能定型

表4 102例RhD初筛阴性围产期妇女标本RHD基因分型结果

2.5 102例不同D表现型在RhCE表型中的分布

见表5。

表5 102例不同D表现型在RhCE表型中的分布(n,%)

3 讨论

从临床角度来看,D抗原在Rh系统的54种血型抗原中是最具免疫原性和重要性的。RhD阴性孕妇产生抗-D的后果是任何涉及RhD阳性胎儿的后续妊娠都具有新生儿溶血病相关的风险。DEL型表达较弱的的D抗原,在不同地区中的遗传频率差异较大。DEL型在亚洲Rh阴性个体中占有较高比例,在日本RhD初筛阴性个体中DEL型占28%[2],国内报道为15.5%～29.95%[3-5]。本研究采用吸收放散试验和PCR-SSP法检出DEL RHD1227A型15例,占14.7%。其中纯合型13例,另外2例为弱D15与DEL RhD1227A杂合型,说明DEL型的分布存在一定的地区差异。其血清表型分别为Ccee、CCee及CcEe,推测1227A可能与C抗原相关,与国内报道称DEL中RhC(+)近100%[6]的理论相符,但是否可通过C抗原与DEL型之间的相关性来确定检测方法还需要进一步研究。中国汉族人群的研究资料表明,DEL型主要由RHD1227A等位基因编码组成[7]。1227A因其位于第9外显子最后一位,影响了mRNA的正常连接形成了短的mRNA,从而降低了RHD基因的表达效率,造成了红细胞膜上的D抗原分子数量明显减少。而有关研究提示编码RhD 1227A等位基因的DEL个体具有完整的D抗原表位[8],如果DEL型表达完整的D抗原,DEL个体将可能不会被D抗原免疫产生免疫应答。

本研究对102例Rh阴性孕妇进行了不规则抗体筛查,有9例产生了抗-D(8.8%),其基因型均为RHD全缺失型,血清表型均为ccee。在真实RhD阴性产妇产生抗-D抗体的比例为12.9%(9/70),其中无妊娠史者4例,生育史大于等于2次有5例。本研究中未发现DEL型孕妇产生抗-D抗体,其中包括有多次孕产史的案例,提示DEL型女性妊娠时可能不被D抗原致敏而产生同种免疫反应,与以往研究相符[9-10]。建议临床医生对此种类型孕妇不需要进行繁杂的抗体检测和预防注射Rh免疫球蛋白,可避免注射免疫球蛋白产生的风险和经济压力,同时也可保存有限的RhD阴性红细胞供应。由此可见,结合血清学检查、吸收放散法和RHD基因分型,更能准确的确认产妇RhD血型,有助于指导临床为RhD阴性产妇制定合理的抗体监测及注射免疫球蛋白相关的预防策略。对RhD阴性孕产妇二次妊娠及新生儿溶血病的及时预防提供科学依据。

本次实验102例RhD阴性标本的血型抗原分型中以ccee(56%)和Ccee(28.4%)频率最高。基因分型中RHD全缺失型70例,占全部标本的68.6%,其Rh表型主要是ccee(78.6%),说明RHD全缺失型与ccee表型高度关联。另外,本研究中还发现10例部分D变异体RHD-CE(2-9)-D型,分别在表型Ccee、ccEe中检出。RHD-CE(2-9)-D型在部分D中最常见,其分子机制是第2～9外显子与相应的RHCE基因产生替换,只能表达部分D抗原。由于氨基酸替换主要发生在胞外区,所以容易刺激机体产生抗体。目前国内已有报道显示[11]RHD-CE(2-9)-D型个体被D抗原致敏产生抗-D抗体,所以该类孕妇需要在整个孕期监测抗-D抗体以及预防注射免疫球蛋白。中国人群中弱D变异体最常见的有弱D15型和弱D12型,本次实验共检测出5例弱D15型,血清分型分别是Ccee(60%)和CcEe(40%)。弱D表型分子机制已被广泛报道[12],由于跨膜区和胞内区发生了氨基酸替换,可能影响红细胞膜的表达,导致红细胞膜上的抗原数量减少,而抗原表位不变。如果弱D型供血者的红细胞输注给了Rh阴性患者,可刺激机体产生同种免疫,产生抗D抗体而引起严重的溶血性输血反应[13]。

综上所述,对于初筛为RhD阴性的孕妇,建议通过血清学试验结合RHD基因分型试验进行DEL型表型和基因型鉴定,根据RhD基因型将其管理为RhD阳性或RhD阴性来制定整个孕期的管理办法。研究RHD基因的变异,对人类输血安全和新生儿溶血病的防御具有重要意义。