建立与青年大鼠神经功能损伤程度相同的老年大鼠大脑中动脉阻塞模型

2023-05-26李祥龙陈香州雷围程李立东杨福兵杨晓波

西南医科大学学报 2023年3期

李祥龙，陈香州，雷围程，李立东，李尧，杨福兵，杨晓波

1.西南医科大学附属医院神经外科（泸州646000）；2.四川省神经外科临床研究中心（泸州646000）；3.西南医科大学科技处（泸州 646000）

脑梗塞是老年人群常见疾病，是人类最常见的致残原因。大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是研究脑缺血性中风的常见动物模型[1-2]，主要用于探索发病机制及新药研发。

在青老年两个年龄组之间的动物对照性实验已经用于一些药物的研发。遗憾的是，在这些对照实验中，两组动物模型的脑损伤程度不一致导致了一些干预措施或治疗效果的评估结果不准确。因此，一些在动物实验中效果良好的药物进入临床试验后，效果不尽人意[3-4]，动物模型的偏倚大大浪费了研发资源。本研究通过调整脑血流量的方法[5-6]，控制大鼠脑损伤程度，从而建立一种与青年大鼠神经功能损伤程度一致的老年大鼠MCAO 模型。用在青年、老年组之间的对照实验，研究药物疗效及毒理学机理等，避免了因动物模型偏倚引起的实验结果不准确。

1 实验动物与方法

1.1 实验动物

青年雄性SPF级SD大鼠（2月龄，280～300 g）及老年雄性SPF 级SD 大鼠（20～22 月龄，750～800 g）被饲养在湿度（63%～65%）及温度（23～25°C）适宜的环境里，定时喂养。在实验中，使用专用动物麻醉装置（R540，瑞沃德，中国）通过异氟烷吸入麻醉大鼠。所有实验流程都获得西南医科大学附属医院伦理委员会审批通过（编号：KY2017035）。

1.2 通过实验确定老年大鼠线栓规格

本研究中的MCAO 模型制作是参考LONGA 和KUTLUAY 报道的方法[7-9]。线栓经右侧颈总动脉分叉处‘a’点插入颈内动脉直至大脑中动脉起点‘b’，从而阻断大脑中动脉的血流。参考已有研究，该实验中青年大鼠的线栓硅胶头直径和插入深度‘ab’分别是0.32 mm 和（18 ± 2）mm[8-10]。通过解剖15 只老年大鼠头颅，测得‘ab’长度为（22±2）mm，见图1A。为了获得线栓硅胶头直径大小，本研究纳入30 只老年大鼠，采用不同硅胶头直径建立3 组MCAO 模型：0.32 mm 组，0.43 mm 组，0.52 mm 组。通过术后第3 d TTC 染色，结果提示，0.52 mm 组大鼠脑梗死严重（45.9±5）%，0.32 mm 组脑梗死不明显（0±1）%，0.43mm 组脑梗塞面积为（16.2±8）%，见图1B。术后7 d 内大鼠生存率统计提示0.52 mm 组大鼠死亡率为80.2%，明显高于0.43 mm组大鼠（29.6%），见图1C。因此，0.43 mm硅胶头更适合用于老年大鼠MCAO模型，用于后续实验。

图1 不同型号线栓引起老年大鼠脑梗死情况Figure 1 Degree of cerebral infarction caused by different size of suture in aged rat

1.3 建立与青年大鼠神经功能损伤程度一致的老年大鼠MCAO模型

大鼠被随机分为4 组：青年假手术组（n=20），老年假手术组（n=20），青年MCAO 组（n=20），老年MCAO 组（n=20）。青年MCAO 组大鼠在显微镜下被分离右侧颈动脉，并用动脉瘤夹夹闭颈总动脉，将线栓硅胶头直径0.32 mm、插入深度（18±2）mm插入右侧大脑中动脉起始部，老年MCAO 组采用线栓硅胶头直径0.43 mm、插入深度（22±2）mm插入右侧大脑中动脉起始部，线栓均在1 h 后取出。青年假手术组、老年假手术组行颈总动脉解剖暴露，用动脉瘤夹夹闭10 s 后松开，不塞入线栓[11]。收缩压（systolic blood pressure，SBP）、pH 值、动脉血氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）、血糖值在整个造模操作中持续监测。

右侧大脑中动脉供血区皮质的局部脑血流量（regional cerebral blood flow，rCBF）通过激光多普勒血流仪（Module LDF100c Biopac Systems，Inc.，USA）持续监测[12-13]。在大脑中动脉阻塞前、阻塞后即刻开始分别监测5 min，阻塞前的rCBF 值作为基线值，阻塞后的rCBF 值与基线值的比值作为阻塞后脑血流量，以此用于统计分析。激光多普勒血流仪探头通过一个头皮切口放置于青年大鼠右侧冠状缝后方2 mm，旁开6 mm处（老年大鼠为右侧冠状缝后3 mm，旁开8 mm）[14-15]，通过调节线栓位置控制rCBF值。

1.4 损伤程度的一致性评价

术前、术后第1、3、7、21 d 作为神经功能评价的时间点，用改良的神经功能评分（modified Neurology Severity Score，mNSS）、角测试评估大鼠神经功能损伤情况[16-18]。mNSS采用18分评分系统，主要从运动、感觉、平衡、反射四方面评价，分数越高损伤越重。角测试中，将大鼠放在成30°夹角的两块木板间，大鼠爬进夹角后转弯爬出，正常大鼠从左侧或右侧爬上木板，而脑缺血损伤的大鼠则偏向于从非瘫痪侧（本实验中为右侧）爬上木板，然后转头返回出口。每只大鼠重复检测10次，从右侧转向的次数记为R，从左侧转向的次数记为L，因此R+L=10，而R/R+L 则表示大鼠的瘫痪程度，值越大表示瘫痪越严重，值越小表示瘫痪越轻微。

通过TUNEL 试剂盒（Roche Applied Science，Germany）检测建模后第3 d 缺血损伤区细胞死亡的情况[19-21]。大鼠脑标本在切片机上切为6 μm 厚度的切片用于检测，共聚焦荧光显微镜下，通过Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，USA）系统计数细胞及采集图片，每张切片取6个视野计数TUNEL-阳性细胞。

1.5 统计学分析

使用SPSS 23.0统计学软件分析数据，连续性变量资料以表示，通过单因素方差分析进行组间比较，用log-rank 检验进行生存率比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

通过调节线栓深度，大鼠rCBF被控制在一个稳定的水平，青年大鼠调节为基线血流的（15±3）%，老年大鼠调节为基线血流的（25±2）%，见图2。

图2 各实验组大鼠的rCBF值Figure 2 rCBF values of rats in each experimental group

通过mNSS及角测试，MCAO大鼠神经功能在脑缺血后第1 d 和第3 d 损伤明显，且青年MCAO 组与老年MCAO 组差异无统计学意义（P＞0.05），随后大鼠神经功能开始恢复，但老年大鼠比青年大鼠恢复慢，21 d时，老年MCAO组神经功能比青年MCAO组差，见图3。

图3 mNSS及角测试对大鼠的神经功能评估Figure 3 Neurological function of rats was evaluated by mNSS and Corner test

术中监测显示，4 个实验组大鼠的SBP、pH 值、PaO2、PaCO2、血糖值在MCAO 术前、术后无明显波动，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠术中生理参数对比Table 1 Comparison of physiological parameters in each group during operation

TUNEL 试剂盒检测结果显示，在缺血损伤后第3 d，青年MCAO 组、老年MCAO 组脑梗死区域的细胞死亡率（青年MCAO 组为31%，老年MCAO 组为32%）差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 大鼠脑梗塞区域细胞死亡情况Figure 4 Cell death in cerebral infarction area of rats

3 讨论

啮齿类动物MCAO 模型由于其操作简便、成本低廉，被广泛用于脑缺血疾病的研究[22-24]。该模型能模拟人类缺血性脑中风的病理生理过程，且脑缺血损伤程度可控，无需开颅操作避免了脑组织机械性损伤[14，25-26]，减少了动物模型导致的实验结果偏倚。然而，现有的研究多数都使用的青年啮齿类动物，特别是在青老年群体对比性研究中，缺乏两年龄段损伤程度一致的模型，导致实验结果评估不准确。人脑缺血性中风后，脑水肿在发病后3～7 d内最严重，神经功能缺失也最明显[27]，这反映了早期脑损伤的严重程度，直接决定后期神经功能的恢复情况。本文建立青年、老年两年龄组大鼠神经功能损伤一致的MCAO 模型，能模拟人脑3～7 d神经功能缺失最严重的状态。该模型可用于早期药物干预效果及机制研究，直接观察干预手段对两个年龄组个体的作用差异及其机理，避免两组模型损伤程度差异造成的结果偏倚。

在本研究中，通过调节rCBF 控制脑缺血损伤程度，建立青年、老年两年龄组大鼠术后3 d 内神经功能损伤程度一致的MCAO 模型，克服了以往研究中该模型的缺点。本研究分两部分完成，线栓硅胶头直径和插入深度是最关键的参数，以往研究中没有相关文献，第一部分实验通过探索获得了较为理想的老年大鼠线栓相关数据：硅胶头直径0.43 mm，插入深度为（22 ±2）mm。第二部分实验中，通过调节rCBF，建立两年龄组损伤程度相同的MCAO模型。

以前研究报道，在青年大鼠MCAO模型中，rCBF一般降低至基线值的30%可以获得比较合适的脑损伤程度[14-15]。本研究通过调整线栓的位置来控制rCBF 大小，结果发现，在两个年龄组中，不同的rCBF可以获得一致的神经功能损伤程度，可能是青年大鼠比老年大鼠有更强的脑缺血代偿能力所致。结果显示青年及老年MCAO组大鼠在手术后1、3 d神经功能损伤严重，且程度一致，之后开始逐渐恢复，老年大鼠恢复更差。青年假手术组、老年假手术组rCBF分别降低为基线值的94.9%、92.5%，可能是颈动脉夹闭后血管痉挛所致。术中生命体征持续监测结果显示SBP、pH、PaO2、PaCO2、血糖值在线栓插入前后无明显差异，提示该实验中线栓型号合适，能在维持稳定的生命体征前提下获得理想的脑梗塞程度。在缺血损伤后第3 d，TUNEL检测发现青年MCAO组与老年MCAO组脑梗死区域的细胞死亡率相同，证明本研究方法能在病理层面做到损伤程度一致，为以后脑中风机制研究提供了参考依据。