基于益生菌发酵的甘蔗汁浓缩工艺

聂梅，黄清铧，胡彪，王庆福，梁磊

广东省科学院生物与医学工程研究所，广东省植物纤维综合利用工程技术研究开发中心，广东省生物质高值化利用工程实验室，广州市植物纤维综合利用重点实验室，药食同源崖柏精油产业化研究工程中心，特色农产品深加工产业创新基地（广州 510316）

甘蔗是温带和热带农作物，其味甘、性寒，归肺、胃经；具有清热解毒、生津止渴、和胃止呕、滋阴润燥等功效；主治口干舌燥，津液不足，小便不利，大便燥结，消化不良，反胃呕吐，呃逆，高热烦渴等[1]。甘蔗中含有丰富的糖分、水分，还含有各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质。现代医学表明，甘蔗具有较强的抗炎、抗氧化、降血糖、正向调节血脂水平等功效[2-5]。近年来甘蔗产业面临诸多瓶颈问题，如蔗糖产能下降市场行情低迷，全球蔗糖产业普遍不景气，缺乏精深加工链等，甘蔗深加工成为国内外近年来加工研究的热点。甘蔗汁营养丰富，含有微生物生长所需的所有营养成分，是良好发酵原料，蔗汁经发酵加工后可制备功能饮料、果酒、果醋等产品[6-8]，不仅拓宽甘蔗深加工多样化产品开发，还丰富发酵饮品品种类型。

试验前期利用复合益生菌协同发酵技术，发挥微生物协同效应，优化饮品风味，生产兼具保健功能和独特风味的高端功能饮品[9-11]。但是由于甘蔗汁具有季节性，这制约着甘蔗汁发酵饮品的生产。为突破甘蔗汁原料的局限性，以甘蔗浓缩汁或红糖为原料，经过复原后评价其发酵性能。由于市面上部分甘蔗浓缩汁添加抗菌成分，这导致复原蔗汁发酵性能受到影响，红糖加工过程经过高温熬煮等工艺，复原后红糖水与甘蔗汁差异较大，显著影响发酵性能。因此以甘蔗复原果汁的抗氧化活性和总酚含量为指标，研究甘蔗汁的浓缩工艺，以及浓缩蔗汁复原后的发酵性能评价，以期得到发酵性能良好的甘蔗浓缩汁，解决甘蔗果汁受季节性影响的局限性问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜甘蔗（广东省科学院生物与医学工程研究所甘蔗种植基地）；植物乳杆菌；酵母菌；醋酸菌；没食子酸、芦丁、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等分析标准品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水乙醇、硝酸铝、醋酸钾、碳酸钠，福林酚等（均为分析纯试剂）。

1.2 方法

1.2.1 黄酮含量测定

黄酮含量参照SN/T 4592——2016《出口食品中总黄酮的测定》，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线y=0.41x+0.030 6，R2=0.99。样品处理：将甘蔗浓缩汁稀释到与原甘蔗汁可溶性固形物一致（13.8%）后，按标准曲线方法进行总酚含量测定。

1.2.2 总酚含量测定

总酚含量参照团体标准T/AHFIA 005——2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定》，并做相应修改。准确吸取没食子酸标准储备液，用60%乙醇溶液配制成质量浓度为0，20，50，100，200和300 mg/L的没食子酸工作液。分别移取1.0 mL没食子酸工作液于10 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚试剂，摇匀，加入2.5 mL 15% Na2CO3溶液，加水定容至刻度，摇匀，在40 ℃水浴60 min，测定其吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线y=0.005 7x+0.105，R2=0.996。样品处理：将甘蔗浓缩汁稀释到与原甘蔗汁可溶性固形物含量一致后，按标准曲线方法进行总酚含量测定。

1.2.3 抗氧化活性评价

1.2.3.1 DPPH自由基清除率

将甘蔗浓缩汁稀释到与原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL的样品加水至1.0 mL，与1.0 mL 0.4 mmol/L DPPH溶液、2 mL 60%乙醇混合均匀，室温下静置30 min，测定波长517 nm处的吸光度Ai。以等体积无水乙醇代替DPPH溶液测定样品本底吸光度Aj，以等体积蒸馏水代替样品溶液测定空白对照吸光度A0。按式（1）计算DPPH自由基清除率。

1.2.3.2 ·OH自由基清除率

将甘蔗浓缩汁稀释到与原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL的样品加水至1.0 mL，加入2.0 mL 1.0 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL 1.0 mmol/L H2O2溶液、2.0 mL蒸馏水、2.0 mL 1.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，混合均匀，室温下静置30 min，测定波长510 nm处的吸光度Ai，以等体积蒸馏水代替H2O2溶液测定样品本底吸光度Aj，以等体积蒸馏水代替多糖样品溶液测定空白对照吸光度A0。按式（1）计算·OH清除率。

1.2.3.3 还原力

通过铁氰化钾法对还原力进行测定。将甘蔗浓缩汁稀释到与原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL样品加水至1.0 mL，与1.0 mL 1%铁氰化钾溶液、1.0 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液混合均匀，在50 ℃水浴反应20 min，加入2.0 mL 10%三氯乙酸，按3 000 r/min离心10 min，取2.0 mL上清液加入2.0 mL蒸馏水、0.4 mL 0.3%三氯化铁，混合均匀，在50℃水浴反应10 min，测定700 nm波长处的吸光度A1，以等体积蒸馏水代替三氯化铁溶液测定空白对照吸光度A2，还原力=A1-A2。

1.2.4 单因素试验

新鲜的甘蔗，洗净，榨汁，经孔径0.48 mm滤网过滤，以去除较大颗粒，获得的甘蔗果汁在真空度0.05 MPa下进行真空浓缩。研究不同浓缩温度、浓缩转速和浓缩产物可溶性固形物含量对浓缩汁总酚含量和DPPH自由基清除率的影响。各因素参数分别为浓缩温度（50，60，70，80和90 ℃）、转速（30，40，50，60和70 r/min），浓缩汁可溶性固形物含量（40%，50%，60%，70%和80%）。

1.2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，采用L9(33)正交试验设计，以黄酮含量（Y1）、总酚含量（Y2）和抗氧化活性（Y3）为综合评价指标，因素水平表如表1所示。

表1 正交试验因素水平表

采用甘蔗汁浓缩产物的总黄酮含量、总酚含量和抗氧化活性3个指标综合加权评分法进行正交试验分析，由于3个评价指标对甘蔗浓缩汁的贡献不一样，因此，将黄酮含量、总酚含量和抗氧化性能的权重系数分别设定为30%，30%和40%，综合评分=（总黄酮含量/甘蔗浓缩汁最高总黄酮含量）×30%+（总酚含量/甘蔗浓缩汁最高总酚含量）×30%+（清除率/甘蔗浓缩汁最高清除率）×40%，以综合评分进行统计分析。

1.2.6 甘蔗浓缩汁对益生菌发酵性能的影响

将甘蔗浓缩汁和甘蔗原汁稀释至可溶性固形物含量8%，pH自然（pH 5.15~5.45），在115 ℃灭菌30 min，即得浓缩汁培养基和原汁培养基。将植物乳杆菌以1%的接种量分别接种浓缩汁和原汁培养基中。植物乳杆菌组置于暗处，在37 ℃静置发酵12 h，酵母菌置于30 ℃，以120 r/min，振荡培养12 h。分别在浓缩汁和原汁培养基中添加4%无水乙醇（0.22 μm过滤器过滤除菌），接入1%醋酸菌种子液，在30 ℃，以120 r/min，振荡培养24 h。通过检测发酵产物的菌落总数、总酸和抗氧化性能指标，比较甘蔗浓缩汁与甘蔗原汁的发酵性能。

1.2.7 菌落总数测定

菌落总数测定参照GB 4789.2——2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。其中，植物乳杆菌采用MRS琼脂培养基涂平板，酵母菌采用YPD琼脂培养基涂平板，醋酸菌采用醋酸菌培养基涂平板（葡萄糖10 g、酵母粉10 g、碳酸钙5 g、琼脂粉20 g、水1 L、pH 5.5）。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，采用Excel计算并作图。采用SPSS 20.0数据处理软件系统进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1（A）浓缩温度对甘蔗浓缩汁抗氧化和总酚含量的影响结果得出，温度大于60 ℃时，甘蔗浓缩汁的多酚含量和抗氧化活性越来越低，浓缩温度在50 ℃和60 ℃时总酚含量没有明显变化，但是采用50 ℃进行浓缩，浓缩时间显著延长。由图1（B）浓缩转速对甘蔗浓缩汁抗氧化和总酚含量的影响结果显示，随着转速的提高，总酚含量和抗氧化随之提高，转速达到60 r/min时，总酚含量最高，抗氧化活性在60 r/min时最好，提高转速略有所降低。图1（C）显示，浓缩汁可溶性固形物含量从40%~80%，按比例复原后蔗汁总酚含量没有明显变化，抗氧化活性则在可溶性固形物含量60%时达到最高。因此，根据单因素结果得出，最适浓缩温度60 ℃、最适浓缩转速60 r/min、最适浓缩汁可溶性固形物含量60%。

图1 单因素试验结果

2.2 正交试验结果

在单因素的基础上选取浓缩温度、浓缩转速、浓缩汁可溶性固形物含量3个因素，采用浓缩汁产物复原到原甘蔗汁可溶性固形物含量一致的黄酮、总酚含量和DPPH抗氧化活性评价3个指标综合加权评分法进行正交试验分析。由表2可知，综合评分最高的组合是A2B3C3，即浓缩温度60 ℃、转速70 r/min、浓缩汁可溶性固形物含量70%。由极差可以看出，因素A浓缩温度的极差最大是主要影响因素，其次是因素C可溶性固形物含量，因素B浓缩转速影响最小，故各因素对甘蔗浓缩汁综合评分的影响程度依次为A＞C＞B。由表3方差分析可知，浓缩温度对甘蔗浓缩汁综合评分有显著影响（P＜0.05），浓缩转速与浓缩汁可溶性固形物对评分没有显著性差异。这可能是因为温度对抗氧化成分包括VC、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）含量及活性变化影响较大[12]而导致。

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

2.3 浓缩汁与甘蔗原汁成分比较

根据正交试验结果，采用最优工艺，即浓缩温度60 ℃、转速70 r/min、浓缩至可溶性固形物含量70%，将浓缩汁和甘蔗汁稀释至可溶性固形物含量为8%，比较浓缩汁和甘蔗汁的成分含量及抗氧化活性，结果如表4所示。甘蔗浓缩汁的总黄酮含量比较高，但是总酚含量却低于甘蔗汁。抗氧化活性结果显示，浓缩汁对DPPH自由基的清除率显著高于甘蔗汁，而羟自由基的清除能力和还原力却无明显差异。经过浓缩加工后，浓缩汁的抗氧化活性高于甘蔗汁，可能是甘蔗汁在浓缩过程糖类与氨基酸发生美拉德反应，得到抗氧化活性较强的美拉德反应产物[13]。

表4 浓缩汁与甘蔗原汁成分与抗氧化性能比较结果

2.4 益生菌发酵性能评价

将经过益生菌发酵后发酵产物10倍系列稀释后，将一定浓度的稀释液定量地接种到琼脂平板培养基上培养48 h，计算菌落总数，结果如表5所示。甘蔗浓缩汁和甘蔗原汁发酵植物乳杆菌活菌总数分别为（2.71±0.13）×1010CFU/mL和（2.65±0.09）×1010CFU/mL；酵母菌存活数分别为（2.33±0.07）×108CFU/mL和（2.36±0.09）×108CFU/mL；醋酸菌存活数分别为（4.21±0.15）×107CFU/mL和（4.17±0.19）×107CFU/mL。通过统计发现甘蔗浓缩汁与甘蔗原汁对益生菌的发酵性能没有显著性差异，说明该工艺浓缩得到的甘蔗浓缩汁可替代甘蔗原汁进行益生菌发酵。

表5 浓缩汁与甘蔗原汁发酵性能评价

3 结论

采用甘蔗汁浓缩产物的总黄酮含量、总酚含量和抗氧化活性3个指标综合加权评分法进行正交试验分析优化，确定最佳提取条件：浓缩温度60 ℃、转速70 r/min、浓缩汁可溶性固形物含量70%。此工艺得到的浓缩汁按比例复原后，其总黄酮含量比甘蔗原汁高，但是总酚含量却低于甘蔗汁，浓缩汁对DPPH自由基的清除率显著高于甘蔗汁，而羟自由基的清除能力和还原力却无明显差异。通过统计发现甘蔗浓缩汁与甘蔗原汁对益生菌的发酵性能没有显著性差异。该方法为甘蔗汁发酵产业提供原料支撑，为进一步开发功能性益生菌发酵果蔬产品提供保障。