雷帕霉素对肺癌SPC-A-1细胞增殖和凋亡的影响

孙潺 张轩斌 赵江 代岩

肺癌属于较为常见的肺原发性恶性肿瘤疾病,发病率及死亡率均比较高,对人们身心健康造成很大威胁[1]。抗肿瘤药物治疗是临床治疗肺癌的一种主要方法[2]。然而,抗肿瘤药物比较多,其抗肿瘤效果也不尽相同[3-4]。雷帕霉素是一种新型免疫抑制剂,早先用于肝移植中发现其具有良好的抗排斥作用[5]。近年来,随着雷帕霉素在临床中的的逐步应用,人们发现其也有一定的抗肿瘤特性,可以抑制肝癌[6]、鼻咽癌[7]、骨肉瘤[8]等细胞的生长及转移。但是,目前关于雷帕霉素对肺癌细胞的影响及作用机制的研究尚不多。本研究旨在通过体外培养人肺癌SPC-A-1细胞,分析不同浓度梯度的雷帕霉素处理SPC-A-1细胞后,对细胞增殖及凋亡产生的影响,并探究其可能的作用机制。

资料与方法

一、材料

人肺癌SPC-A-1细胞购自上海弘顺生物科技有限公司。胰酶购自江苏凯基生物技术股份有限公司。胎牛血清购自郑州九龙生物制品有限公司。雷帕霉素购自广州硕恒生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。FITC-Annexin V/PI双染色法细胞凋亡试剂盒购自上海莼试生物技术有限公司。

p53、Bax、Bcl-2、GAPDH等抗体购自广州奕源生物科技有限公司公司。倒置显微镜购自德国徕卡集团有限公司。酶标仪购自北京凯奥科技发展有限公司。流式细胞仪购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。

二、方法

1 CCK-8法测定SPC-A-1细胞增殖 选择对数生长期的SPC-A-1细胞,采用胰酶溶液将其消化成为单细胞的悬液,并将其接种在96孔板上。其中,空白对照组(雷帕霉素,0 ng/mL)和雷帕霉素组分别设置5个复孔,每个孔滴入200 μL的SPC-A-1细胞悬液,过夜,空白对照组给予换用200μL的新鲜培养基,雷帕霉素组分别换用200μL含有不同浓度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培养基,放入37℃,5%二氧化碳条件下的培养箱中进行培养。培养48h之后,于避光的环境中,在每孔滴入20 μL的CCK-8溶液,然后再孵育3h。采用酶标仪测定对每孔的吸光度(波长为450 nm)进行测定。算出各组SPC-A-1细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(空白对照组吸光度值-雷帕霉素组吸光度值)/空白对照组吸光度值 ×100%。

2 FITC-Annexin V/PI双染色法测定SPC-A-1细胞凋亡 选择对数生长期的SPC-A-1细胞,采用胰酶溶液将其消化成为单细胞的悬液,并将其接种在6孔培养板上。过夜,SPC-A-1细胞贴壁之后,空白对照组换用新鲜培养基,雷帕霉素组分别换用含有不同浓度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培养基,并再培养48h。采用不含EDTA的胰蛋白酶对SPC-A-1细胞进行消化;运用PBS溶液对SPC-A-1细胞洗涤2次,离心5 min,收集SPC-A-1细胞,并加入FITC-Annexin V/PI试剂盒混匀,于避光及室温条件下再次孵育20 min。采用流式细胞仪测定各组SPC-A-1细胞凋亡率。

3 Western Blot法测定凋亡蛋白表达水平 选择对数生长期的SPC-A-1细胞,采用胰酶溶液将其消化成为单细胞的悬液,并将其接种在6孔培养板上。过夜,SPC-A-1细胞贴壁之后,空白对照组换用新鲜培养基,雷帕霉素组分别换用含有不同浓度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培养基,并再使用培养箱培养48h。随后,每孔滴入200μL细胞裂解液,在冰上裂解半小时之后,离心25 min后收集上清,冷藏备用。运用BCA法实施蛋白定量操作之后,实施SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作,转膜完毕,使用Western洗涤液对蛋白膜进行漂洗2 min,滴入Western封闭液,加入一抗(p53、Bcl-2、Bax)稀释液(1:5000),加入二抗(辣根过氧化物酶标记的IgG抗体)稀释液,显影扫描。所测蛋白相对表达量=目标蛋白条带的灰度值/内参β-actin的灰度值。

三、统计学处理

结 果

一、SPC-A-1细胞增殖的对比

5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素处理后的SPC-A-1细胞增殖数较空白对照组显著下降(P<0.05),增殖抑制率显著上升(P<0.05),且增殖抑制率与雷帕霉素存在剂量依赖性的关系(见图1、表1)。

图1 雷帕霉素对SPC-A-1细胞增殖的抑制作用注:与对照组比较,*P<0.05

表1 各组SPC-A-1细胞增殖的对比

二、SPC-A-1细胞凋亡的对比

与空白对照组比较,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素处理组的细胞凋亡率均有显著性上升(均P<0.05),其中15 ng/mL雷帕霉素处理组细胞凋亡率最高,其凋亡率变化存在剂量依赖性关系。随着雷帕霉素处理浓度的升高,处于G0/G1期的细胞比例明显上升(P<0.05),处于S期或G2/M期的细胞比例明显下降(P<0.05),表明雷帕霉素可将SPC-A-1细胞增殖阻滞于G0/G1期(见表2)。

表2 SPC-A-1细胞凋亡的对比

三、SPC-A-1细胞凋亡蛋白p53、Bcl-2、Bax表达水平的对比

与空白对照组比较,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素处理SPC-A-1细胞后的p53、Bax蛋白水平上升,Bcl-2蛋白水平下降(P<0.05)(见图2,图3)。

图2 Western Blot法测定细胞凋亡蛋白p53、Bax、Bcl-2的表达水平A:空白对照组;B:5 ng/mL 雷帕霉素;C:10 ng/mL 雷帕霉素; D:15 ng/mL雷帕霉素

图3 细胞凋亡蛋白p53、Bax、Bcl-2的相对表达量的对比注:与空白对照组比较,*P<0.05

四、p53、Bax、Bcl-2蛋白表达水平与细胞凋亡率的相关性

取上述3板15 ng/mL雷帕霉素处理组细胞,经15 ng/mL雷帕霉素处理72h后,15 ng/mL雷帕霉素处理组细胞p53、Bax蛋白表达水平均与细胞凋亡率呈正相关(r=0.906,P<0.05;r=0.938,P<0.05);Bcl-2蛋白表达水平与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.712,P<0.05),表明p53、Bax蛋白能促进SPC-A-1细胞凋亡,Bcl-2蛋白能抑制SPC-A-1细胞凋亡(见图4～6)。

图4 p53蛋白表达水平与细胞凋亡率呈正相关(r=0.906,P<0.05)

图5 Bax蛋白表达水平与细胞凋亡率呈正相关(r=0.938,P<0.05)

图6 Bcl-2蛋白表达水平与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.712,P<0.05)

讨 论

细胞增殖、凋亡和癌细胞死亡紧密相关[9]。Rastegar等人研究发现[10],雷帕霉素可诱导肝癌细胞凋亡。有研究表明[11],雷帕霉素联合奥沙利铂具有协同效应,可以有效诱导HCT116结肠癌细胞发生凋亡。本研究发现,雷帕霉素体外处理人肺癌SPC-A-1细胞后对细胞的增殖具有抑制作用,对细胞凋亡具有诱导作用,且其作用呈剂量依赖性。此结论与牛慧彦等报道的雷帕霉素可以抑制肺癌细胞发生增殖,诱导其凋亡的的研究结果基本一致[12]。

癌细胞增殖、凋亡均受到多种基因的正性调控与负性调控,其增殖、凋亡机制均较为复杂。p53抑癌基因p53属于一种较为重要的抑癌基因,它发生突变跟人类肿瘤密切相关[13]。Bcl-2的表达水平的高低与癌细胞存活至关重要。有研究显示[14],Bcl-2转录调控与卵巢癌细胞的增殖及凋亡密切相关。Bax是一种重要的促凋亡基因。已有研究证实[15],Bax可以促进肝癌细胞凋亡。本研究显示,与对照组(雷帕霉素,0 ng/mL)比较,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素处理对SPC-A-1细胞的凋亡率上升(P<0.05),且p53与Bax蛋白水平增加(P<0.05),而Bcl-2蛋白水平下降(P<0.05)。此外,本研究还发现,15 ng/mL雷帕霉素处理组细胞p53、Bax蛋白表达水平均与细胞凋亡率呈正相关(r=0.906,P<0.05;r=0.938,P<0.05);Bcl-2蛋白表达水平与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.712,P<0.05)。提示,雷帕霉素抑制人肺癌SPC-A-1细胞发生增殖并可促进其发生凋亡的作用机制,可能与雷帕霉素可以上调p53、Bax蛋白表达水平和下调Bcl-2蛋白表达水平相关。

综上,本实验研究表明,雷帕霉素对人肺癌SPC-A-1细胞增殖具有抑制作用,在48h内可以有效地诱导人肺癌SPC-A-1细胞发生凋亡。本实验结果为更好地开发利用雷帕霉素的抗肿瘤作用提供了一定的参考依据。