葡萄籽多酚对心肌梗死大鼠NF-κB信号通路及肾功能的影响

武报佳,郭 华,邢慧敏,赵 睿,孙 波,马 冬

心肌梗死是高发的心血管疾病,随着人科生活压力增加及生活习惯改变,心肌梗死发病率逐渐升高,且呈年轻化趋势,且致死率较高,严重威胁人们的生命安全[1]。有研究显示,随着心肌梗死疾病恶化并发展为急性肾损伤的发病率升高,美国研究中心对4万多例急性心肌梗死病人进行随访发现,超过5.2%病人发生不同程度的急性肾损伤[2]。有研究证实,心肌梗死病人肾功能指标血肌酐(Cr)含量变化证实病人肾小球过滤功能存在异常[3]。核转录因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一种具有生物调节作用的蛋白质,可介导炎症反应、细胞生物活性及免疫应答等,其在心肌梗死生理病理中发挥着重要作用[4]。NF-κB受Rel家族及IκB家族影响,受到细胞外刺激后与IκB激酶α/β(IκKα/β)形成复合物,游离的NF-κB进入细胞核发挥靶基因调控作用。

葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)富含多种化学成分,是从葡萄籽种中提取的具有抗氧化作用的天然物质,具有无毒性、生物利用度高等优点[5]。葡萄籽多酚可发挥抗氧化及清除自由基等作用,改善心血管疾病。朱建鸿等[6]研究表明,葡萄籽多酚对心血管合并动脉硬化、糖尿病及高血糖具有保护作用。关于心肌梗死肾功能的研究处于探讨阶段,本研究观察葡萄籽多酚对心肌梗死大鼠NF-κB信号通路及肾功能的影响,为相关研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级SD雄雌各半大鼠50只,鼠龄6周,体质量200～300 g,许可证号：SCXK(浙)2019-0010。饲养环境：湿度为55%,温度为25 ℃,模拟明暗交替无菌饮食2周,定时清洗、消毒鼠笼,实验符合《实验动物管理条例》规定管理规定。

1.2 实验药物、试剂与仪器 葡萄籽多酚(陕西锦泰生物工程有限公司,JT-10236);戊巴比妥钠(上海行知化工厂,921019);阿托品(河南润弘制药股份有限公司,20150528);青霉素钠(江西大赣农动物药业有限公司,140591248);NF-κB抗体(深圳市豪地华拓生物科技有限公司,PL0403111);NF-κBp65抗体(上海恒斐生物科技有限公司,ab140751);IκKβ(上海雅吉生物科技有限公司,YS-13644R)。苏木素染液(北京伊塔有限公司,YT8370);3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(上海雅吉有限公司,I026);实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒(美国ABI公司,7000);cDNA第一链合成试剂盒(北京天根有限公司,KR104);IP裂解液(北京百奥莱博有限公司,SY0318);二喹啉甲酸法(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(南京诺唯赞有限公司,E112-01)。

1.3 心肌梗死大鼠模型构建 参照相关文献[7]建立心肌梗死大鼠模型,50只大鼠称量体质量,清除气管分泌物,腹腔注射60 mg/kg的阿托品、5 mg/kg的地西泮及30 mg/kg的氯胺酮麻醉,仰卧位后固定于操作台上,暴露胸部并连接小动物呼吸机,剔除左侧胸腔毛发消毒后在第4肋间与第5肋间切开皮肤,置入开胸器暴露心脏,剪开心包,于肺动脉及左侧心耳距离主动脉根部0.2 cm分别用4-0线及8-0手术针结扎左冠状动脉前降支,建立心肌梗死模型,撤离开胸器,青霉素冲洗胸腔后用2-0线缝合皮肤,大鼠清醒后撤除呼吸机。假手术组除不结扎左冠状动脉前降支外其余同上。造模24 h后,测定A组(假手术组)和B组(心肌梗死模型组)的心电图验证建模是否成功,心电图ST段抬高,提示模型构建成功。详见图1。

图1 A组及B组大鼠心电图表现

1.4 动物分组及干预方法 将50只大鼠按照平均体质量分为A组(假手术组)、B组(心肌梗死模型组)、C组(心肌梗死模型+低剂量葡萄籽多酚组)、D组(心肌梗死模型+高剂量葡萄籽多酚组)及E组(心肌梗死模型+血府逐瘀胶囊组),每组10只。C组和D组大鼠建模后灌胃由蒸馏水稀释的100 mg/kg及300 mg/kg葡萄籽多酚,E组大鼠灌胃250 mg/kg的血府逐瘀胶囊。连续14 d,每日1次。A组及B组大鼠灌胃等体积生理盐水,时间、次数同其他组。

1.5 超声测定心脏功能 末次灌胃后采用40 mg/kg的戊巴比妥麻醉,采用多普勒超声在二维影像指导下测定大鼠平均动脉压(MAP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末期压力(LVEDP),连续测定3次,取平均值。

1.6 肾功能检测 末次灌胃后,采集大鼠眼眶静脉血1.5 mL,采用低速离心机以3 000 r/min、离心半径为10 cm运转10 min,保留上清液,采用反比色法检测血清Cr、尿素氮(BUN)水平。采血前24 h将大鼠分笼饲养,收集尿液,采用黄基水杨酸-硫酸钠比浊法检测24 h尿蛋白(UP24),方法按照说明书进行。

1.7 组织病理学检查 上述实验结束后,采用颈部脱臼法处死大鼠,取大鼠心脏、1个肾脏,剔除周围组织置入甲醛溶液中固定,组织切片后石蜡包埋,5 μm切边,脱蜡10 min后利用95%乙醇水化,采用碱性苏木精进行染色15 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次,蒸馏水清洗,再利用0.5 mL伊红染色3 min,PBS清洗,在200倍显微镜下观察心肌及肾脏组织病理改变。

1.8 免疫印迹检测肾脏组织NF-κB抗体、NF-κBp65抗体、IκKβ抗体蛋白水平 肾脏组织加入0.125%胰蛋白裂解液,4 000 r/min离心后,在血清样品中加入样孔。进行电泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡10 min,反复PBS冲洗,每次5 min,分别加入NF-κB抗体、NF-κBp65抗体、IκKβ抗体及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(1∶500)、过氧化物酶标记二抗(1∶2 000),杂交处理4 h后,冲洗,将膜浸入电化学发光(ECL)工作液,检测获取图像。

1.9 qRT-PCR检测肾脏组织NF-κB抗体、NF-κBp65抗体、IκKβ抗体 mRNA 肾脏组织经0.125%胰蛋白酶消化,冲洗后置于无菌试管中,提取其RNA,75%乙醇离心,-80 ℃保存。将RNA转化DNA,加入NF-κB抗体、NF-κBp65抗体、IκKβ抗体及NF-κB抗体,内参采用GAPDH,60 ℃预变性、10 min,95 ℃变性、72 ℃退火,各30 s、95 ℃延伸,5 min,循环次数以40次为准,采用2-ΔΔCt计算相对表达水平,引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 各组大鼠LVEDP、MAP及LVSP比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与A组比较,B组大鼠LVEDP升高,MAP及LVSP降低(P<0.05);与B组比较,C组、D组及E组大鼠心脏功能改善明显(P<0.05);D组与C组大鼠心功能指标比较,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心功能指标比较(±s) 单位：mmHg

2.2 各组大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平比较 与A组比较,B组血Cr、BUN和尿UP24升高(P<0.05);与B组比较,C组、D组及E组大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平降低(P<0.05);D组大鼠血Cr、BUN和尿UP24低于C组(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平比较(±s)

2.3 各组大鼠HE染色比较 心肌组织病理：A组大鼠心肌纤维整齐,形态椭圆形,细胞纹理清晰;B组细胞质出现血管水肿出血,心肌组织纤维扩张,肌丝溶解;C组、D组及E组细胞质水肿减少,间隙改善,结构接近正常。肾脏组织病理：A组肾脏组织结构完整,由肾小管和肾小球结构良好,B组肾小球间质增多,肾间质增宽,炎症浸润严重,肾小管严重萎缩,C组、D组及E组肾脏组织病理显著改善,肾小球硬度降低,炎症浸润改善。详见图2。

图2 各组大鼠心肌组织及肾脏组织病理改变(HE,×200)

2.4 免疫印迹检测各组大鼠肾脏组织NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表达比较 B组大鼠肾脏组织NF-κBp65、NF-κB及IκKβ蛋白表达水平高于A组(P<0.05);与B组比较,C组、D组及E组大鼠肾脏组织NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表达水平降低(P<0.05);D组大鼠NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表达水平低于C组(P<0.05)。详见表4、图3。

表4 各组大鼠肾脏组织NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表达比较(±s)

图3 各组大鼠肾脏组织NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表达条带图

2.5 各组大鼠肾脏组织NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表达比较 与A组比较,B组NF-κBp65、NF-κB及IκKβ mRNA表达升高(P<0.05);C组、D组及E组NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表达低于B组(P<0.05);与C组比较,D组大鼠NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表达降低(P<0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠肾脏组织NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表达比较(±s)

3 讨 论

心肌梗死是常见的心内科疾病,心肌梗死导致大量心肌细胞坏死降低心脏功能,影响病人生命安全。目前多种动物均可建立心肌梗死模型,SD大鼠具有价格便宜及适用于个体研究的优点而被广泛应用。心肌梗死常伴有高脂血症,高脂血症可损伤肾脏,加重肾小管损伤,影响肾功能。有研究表明,心肌梗死产生大量氧自由基,增加肾脏毒性,诱导肾上皮细胞凋亡,增加肾脏综合征发生发展[8]。目前,多采用药物治疗心肌梗死,西医长时间治疗毒副作用较大,因此寻找合适药物干预对改善心肌梗死肾脏损伤具有重要的临床意义。

超声检查是诊断心肌梗死的无创辅助检查,可对心脏功能进行准确检查并评估心肌梗死严重程度。心肌梗死普遍存在心排血量减少,舒张末期容积减小,心室充盈压力增加,进一步提高心脏压力,导致LVSP、MAP及LVSP异常[9]。心肌梗死病人心肌组织存在不同程度的缺血缺氧,心室收缩不同步,限制了心脏每搏输出量(SV)及心脏指数(CI)编导,从而影响心室收缩功能,导致LVEDP降低[10]。本研究结果显示,经葡萄籽多酚干预后心肌梗死大鼠心脏功能改善,高浓度葡萄籽多酚的干预作用与血府逐瘀胶囊相似。

血府逐瘀胶囊是在血府逐瘀汤基础上加减而成的中成药,是治疗“胸中血府血瘀”诸症的常用药物,主要成分当归、川芎可养血通经;生地可活血养阴;赤芍、牛膝、红花活血化瘀;柴胡、桔梗具有疏肝解郁、宣肺理气作用[11]。血府逐瘀胶囊治疗可改善急性心肌梗死急诊经皮冠状动脉介入(PCI)术后心力衰竭病人心功能,其机制可能与减轻炎症反应、保护血管内皮功能有关[12]。葡萄籽多酚是一种在蔬菜和水果中存在的天然提取物,包括多种化学元素,其中白藜芦醇可减少心肌梗死大鼠心脏及肾脏氧化,而多酚在抗肿瘤同时具有强大的心脏功能保护作用。吴婷玉等[13]研究显示,葡萄籽多酚提取物可降低高血压大鼠血压,通过抗氧化发挥心脏功能保护作用。

心肌组织中血管紧张素及醛固酮可加重肾组织纤维化,加快肾小球硬化,降低肾功能[14-15]。本研究结果显示,葡萄籽多酚可改善大鼠肾功能,并存在浓度依赖性,高浓度葡萄籽多酚对心肌梗死大鼠肾功能改善最显著,与武报佳[16]研究结果相似。葡萄籽多酚属于血管扩张剂,发挥保护心脏,对其他器官特异性保护作用得到证实,对阿霉素及顺铂导致的急性肾损伤时采用葡萄籽多酚干预对肾损伤有预防作用,其机制与葡萄籽多酚增加抗氧化作用有关。本研究结果显示,葡萄籽多酚治疗后大鼠心肌组织及肾组织病理形态均有所改善,其机制与抑制大鼠肾组织NF-κB/IκKβ信号通路有关。

NF-κB是多功能核转录因子,主要由5种不同亚单位组成,其典型的成员为NF-κBp65,静息状态下NF-κB与IκKβ结合后,与无活性的三聚体共同存在于细胞质,细胞受到刺激后NF-κB被激活,暴露细胞核靶点,使其顺利进入细胞核,从而发挥调控靶基因的作用[17]。NF-κB/IκKβ可介导氧化反应及炎症反应等,加重心肌梗死病理生理发生。IκK是IκB上的蛋白激酶,也是激活NF-κB的经典产物,可结合IκBα相关Ser36等指标磷酸化发生降解,促使NF-κB分离,启动细胞核基因转录作用[18]。NF-κB可调控免疫及炎症相关基因,启动肾小管上皮细胞损伤机制,通过上调p53表达介导肾组织纤维化。本研究结果显示,葡萄籽多酚可抑制心肌梗死大鼠肾组织NF-κB/IκKβ信号活性,存在浓度依赖性。葡萄籽多酚通过阻断IκKβ信号表达,减少相关信号发生降解,加快NF-κB失活而减少肾组织氧化及炎症应激损伤。梁冬冬等[19]研究显示,葡萄籽多酚活性成分儿茶酸通过减少NF-κB表达,抑制其进入细胞核,降低了p53磷酸化,改善肾小球上皮细胞存活周期,提高细胞存活率。李方等[20]研究显示,葡萄籽多酚中包含的白藜芦醇可改善高脂血症大鼠肾脏功能,其作用机制可能与抑制NF-κB活性、降低单核细胞趋化蛋白-1表达有关。

综上所述,葡萄籽多酚可增加心肌梗死大鼠心脏功能,提高肾功能,改善心肌及肾脏组织病理损伤,其机制与抑制NF-κB、NF-κBp65及IκKβ活性有关。