红参低氘水精华液的研发

段瑞培, 刘如佳, 刘祎宁, 罗元鸿, 崔承弼

(延边大学 农学院,吉林 延吉 133000)

红参为人参经蒸制后的干燥根和根茎[1]。红参性温,具有调节神经、心血管和内分泌,补气益血、养心安神等功效。红参具有抗氧化能力,可清除羟自由基,其活性成分中的Rg5清除自由基的效果最佳[2]。

低氘水(LDW)是指氘丰度低于天然丰度的水,是一种稳定同位素产品。低氘水可以预防疾病、延缓衰老、活化机体免疫细胞,防治癌症[3]。低氘水是改进化妆品品质的安全且有效的组分,有助于提高皮肤细胞抗老化、保湿、抗紫外线照射、抗过敏等功能[4]。

黄原胶分子中含有大量的亲水基团,是一种良好的表面活性物质,具有抗氧化、防止皮肤衰老等功效。因此,几乎绝大多数高档化妆品都将黄原胶作为其主要功能成分[5]。王昌涛等以甘油作为保湿剂,研究其保湿功效,得出化妆品中添加甘油有良好的保湿效果[6]。因此,该试验选择以低氘水研制红参功效成分的精华液,以期达到具有显著美白功效、显著抗氧化能力、符合化妆品行业有关规定的精华液。

1 材料与设备

1.1 材料

低氘水(泸州哈罗德健康科技有限公司);红参(长白山科学研究院提供);75%乙醇;甘油;黄原胶;乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠);透明质酸钠;1,3-丁二醇;尿囊素;蓖麻油;青花香精;蒸馏水;维生素C(Vc);磷酸盐缓冲溶液(PBS,Gibco公司);L-酪氨酸(Sigma试剂公司);酪氨酸酶(诺维信生物技术有限公司)。

1.2 设备

电热恒温水浴锅(HWS-24型,上海百典仪器设备有限公司);水浴锅(OSB-2100-CE型,东京理化器械株式会社);落地式连续投料粉碎机(DF-35,温岭市林大机械有限公司);多功能荧光酶标仪(SP-Max3500FL型,上海闪谱生物科技有限公司);离心机(TG16A-WS型,上海卢湘仪器有限公司);分析天平(FA2004型,上海上平仪器有限公司);立式鼓风干燥箱(DHC-9620A型,上海百典仪器设备有限公司);pH计(FE28型)。

2 试验方法

2.1 红参提取方法

采用水提醇沉法[7]提取红参中的有效成分。200 g红参称重粉碎,按照料液比1∶20(g∶mL)加入75%乙醇,40 ℃蒸煮2 h,用离心机以4 000 r/min离心3 min,取上清液,滤渣重复操作1次,最后结合3次离心的上清液进行旋蒸浓缩,离心取上清液,将上清液置于-80 ℃冷冻后冻干成粉末,提取物粉末密封保存在4 ℃冰箱中[8]。

2.2 单因素与正交试验

2.2.1 单因素试验

1) 标准品溶液 准确称取红参粉末0.1 g(精确到0.000 1 g)置于10 mL容量瓶,蒸馏水定容,配制成10%的储备液。

参考李波等[9]制作灵芝面膜精华液的基础配方,选定红参提取液添加量、甘油添加量以及黄原胶添加量作为单因素试验的对象,在此基础配方中黄原胶的质量分数为0.05%～0.25%,参考林志魁等[10]研制的一种新型琼胶寡糖面膜精华液中甘油添加量4%～12%、琼胶寡糖添加量0.6%～1.4%,制定单因素试验的浓度梯度。

2) 红参提取液添加量的选择 在甘油10%,黄原胶0.15%的条件下,以0.5%、1%、2%、3%和4%(质量分数)的红参提取液浓度进行单因素试验,根据感官评价确定3个最优值,以确定制作功能性低氘水精华液中红参提取液的最优浓度。

3) 甘油添加量的选择 在红参提取液1%,黄原胶0.15%的条件下,以6%、8%、10%、12%和14%的甘油添加量进行单因素试验,根据感官评价确定3个最优值,以确定制作精华液甘油的最优添加量。

4) 黄原胶添加量的选择 在红参提取液1%,甘油10%的条件下,以0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的黄原胶添加量进行单因素试验,根据感官评价确定3个最优值,以确定制作精华液黄原胶的最优添加量。

精华液感官标准如表1所示。

表1 精华液感官评价指标

2.2.2 正交试验

利用正交试验表L9(33)设计试验,正交试验设计如下(表2)。

将红参提取液(0.5%、1%、2%)、甘油(8%、10%、12%)、黄原胶(0.10%、0.15%、0.20%)作为变量,进行3因素3水平试验。DPPH自由基在517 nm下有吸收峰[11],在517 nm测定各组的DPPH自由基清除率,以DPPH自由基清除率作为正交试验结果的判断依据。

表2 正交试验设计表

DPPH自由基清除率试验操作时,按表3在96孔板中进行点样:对照组(AC)加入20 μL蒸馏水、180 μL DPPH(DPPH浓度:称取1.971 6 mg DPPH,在闭光环境中用无水乙醇定容至50 mL);空白组(ACB)加入20 μL蒸馏水、180 μL乙醇;样品组 (AS)加入20 μL不同浓度的样品溶液、180 μL DPPH;样品空白组 (ASB)加入20 μL不同浓度的样品溶液、180 μL乙醇(75%);点样完成后,在避光条件下,在560 nm处测定吸光度[12]。每个样品重复检测3次,结果取平均值。

表3 DPPH自由基清除试验

所得数据根据公式计算DPPH自由基清除率:

式中,AC:对照组吸光度;ACB:空白组吸光度;AS:样品组吸光度;ASB:样品空白组吸光度。

2.3 精华液的制备

在制备过程中使用的仪器与设备均需经过紫外线灭菌和乙醇消毒。产品配方参考李波等[9,13-14]人制备灵芝面膜精华液的方法(表4)。

表4 低氘水精华液的配方

1) 制备A相溶液:取甘油、黄原胶、尿囊素、1,3-丁二醇、蓖麻油,在80～90 ℃水浴条件下加热,搅拌均匀。

2) 制备B相溶液:取适量低氘水,加入EDTA二钠、红参提取液,搅拌至溶解完全。

3) 将A相溶液加入B相溶液中,搅拌均匀,在80～ 90 ℃下保温30 min,继续搅拌10 min,冷却后加入C相溶液,继续搅拌5 min,即得红参精华液。

2.4 理化指标的测定

2.4.1 pH值测定

参考林志魁[10]的方法,取1 mL精华液,加入去离子水9 mL,充分搅拌并加热至40 ℃,放置冷却至室温,用pH计测定其pH值,每个样品测定3次,取其平均值。参照GB/T 13531.1-2008《化妆品通用检测法》,pH值在3.5～8.5均符合要求。

2.4.2 离心稳定性测试

取5 g于10 mL离心管中,于3 000 r/min离心15 min,观察其是否有分层、浮油、变色等现象[15]。

2.4.3 美白功效的评定

通过对酪氨酸酶活性的影响试验判定该精华液的美白功效。

参照文献[16],取1 mL精华液,将其稀释至1、1.5、2、2.5、3 mL。按表5在2 mL离心管中加入pH值6.8的PBS缓冲液、样品溶液、质量分数0.1%的L-酪氨酸溶液、用磷酸盐缓冲溶液配制的质量浓度为200 μg/mL的酪氨酸酶溶液,每组的总反应体系为1.4 mL。将溶液充分摇匀后,在37 ℃水浴锅中加热20 min。取出后,向96孔板点样,每个孔中加入200 μL样液,在475 nm处测定其吸光度。

每组稀释样品以同浓度VC作为阳性对照(称取与样品相同的质量,定容到相同体积的容量瓶中,用与样品的稀释倍数相同的溶剂,稀释成与样品相同的浓度梯度)。

表5 抑制酪氨酸酶试验

根据公式计算得出样品对酪氨酸酶的抑制率:

2.5 安全性评价

通过人体试用实验观察样品对人体皮肤的安全性,选取年龄在20～55岁的33名志愿者组成安全性评价小组。受试者直接将精华液涂抹于手背。电话随访受试者有无皮肤反应或全身性不良反应如恶心、乏力、月经紊乱及其他不适等,观察涂抹样品部位皮肤反应,按表6皮肤反应分级标准记录结果。试用时间为8周。受试者回访时,仔细询问、检查并记录受试者在使用样品期间所发生的任何不良事件[17-18]。

表6 人体试用试验皮肤反应分级标准

3 结果与分析

3.1 单因素与正交试验

红参提取物具有滋养皮肤、防治皮肤粗糙和生成小皱纹等功效,其用量对精华液品质的影响为:随红参提取物含量的增加,精华液感官评分呈先上升后下降的趋势,在添加量为0.5%～2%时,分值较高(表7)。红参提取物呈红褐色,添加量过多时精华液颜色过深。在一定范围内,DPPH自由基清除率与摩尔浓度呈正相关关系[19]。经成本、评分等多因素综合分析,选择0.5%、1%和2%的红参提取物含量作进一步的正交试验。

表7 红参提取物添加量对精华液感官品质的影响

甘油是一种常用的化妆品保湿剂,会对产品的黏感、厚重感、滋润度和补水性起作用。但甘油具有一定的黏性,因此甘油添加量过低或过高都会对以上指标产生不良影响。经此次单因素试验后,选取8%、10%和12%的添加量进行正交试验(表8)。

表8 甘油添加量对精华液感官品质的影响

黄原胶又名黄杆菌胶,是一种天然食品增稠剂。黄原胶在精华液中主要作增稠剂使用[20],添加量过多会导致精华液过稠而厚重油腻,不易被皮肤吸收;添加量过少会导致精华液过稀,延展性过强,像水一样。因此,根据试验结果,选取0.1%、0.15%和0.2%作正交试验(表9)。

表9 黄原胶添加量对精华液感官品质的影响

最终选取红参提取液0.5%、1%、2%,甘油8%、10%、12%,黄原胶0.1%、0.15%、0.2%进行正交试验,用以确定最终配方。

取红参、甘油、黄原胶进行DPPH自由基清除率试验,结果如表10所示。

表10 低氘水精华液配方正交试验结果

由试验结果可知,最佳因素组合为A3B1C3,即红参提取液2%,甘油8%,黄原胶0.2%时,对DPPH的清除效果最好。其中,红参是发挥抗氧化作用的主要成分,甘油作为保湿剂,黄原胶因其含有大量的亲水基团,作为流变调节剂,并兼有抗氧化、抗衰老等功效。

3.2 理化性质

3.2.1 pH值测定

用pH计测定样品的pH值,3次测定结果均为5.2,符合《化妆品通用检测法》所规定的要求。

3.2.2 离心稳定性测试

离心管中的5 mL精华液在经过3 000 r/min离心15 min后,并未出现分层、浮油、变色等现象,表明精华液具有良好的离心稳定性。

3.2.3 美白功效的评定

美白过程是指抑制酪氨酸酶活性,对作用于黑色素代谢的各个阶段进行调控,从而达到抑制黑色素生成的目的。参与黑色素合成过程的一系列酶中最关键的是酪氨酸酶[21],研究表明酪氨酸酶活性过高会导致黑色素过度地生成,还会导致人体皮肤产生色素性疾病[22],对酪氨酸酶进行活性调节是影响黑色素合成的关键。因此,对酪氨酸酶的抑制作用是评价美白作用的一项重要指标。从试验结果可以看到,未稀释的精华液对酪氨酸酶的抑制率最大,随着精华液稀释倍数的增加,其对酪氨酸酶的抑制率也下降。因此,通过对酪氨酸酶活性的影响试验可以判定该精华液的美白功效(表11)。

表11 低氘水精华液的酪氨酸酶抑制率

3.3 产品安全性评估

研究期间33名受试者仅1位出现微弱红斑,参考表6中规定的人体试用皮肤不良反应分级标准,评定测试样品具有良好的安全性[23](表12)。

表12 安全性评价表

4 讨论与结论

目前,市场上常见的精华液以灵芝[9]、茶叶[24]为主要的天然成分,还有不少对天然多糖类[25]和中药材类[26]精华液的研究。而该试验以红参为主要成分,以低氘水为特色成分,侧重于配方优化,后续对其功能活性进行了研究。

红参多糖能清除DPPH自由基和羟自由基[27],在正交试验中,红参提取液清除DPPH自由基的能力随着浓度(0.5%→2%)的增加而增强,这与李慧萍[28]证明的红参提取物含量与其体外抗氧化能力呈现一定的相关关系一致。且与袁元等[29]人的研究结果一致,但袁元等人的研究主要侧重于对红参、白参和黑参抗氧化效果的对比,黑参强于红参和白参,因此,能否用黑参代替红参作为精华液的有效成分还有待探索。

红参提取物的添加量影响精华液的色泽和抗氧化性。甘油作为主要的保湿剂,可以保护皮肤的表皮层和真皮层的水分不流失,使肌肤保持良好状态。黄原胶作为增稠剂,起到使产品性质稳定不分层的功效,但过量时易导致成品过于黏稠,功效成分无法被完全吸收。经正交试验最终选定的精华液配方为:红参提取液2%、甘油8%、黄原胶0.2%、1,3-丁二醇5%、蓖麻油1%、尿囊素0.2%、EDTA二钠0.03%、香精0.05%,最后低氘水补至100 mL。

从试验结果来看,红参低氘水精华液对酪氨酸酶具有显著的抑制作用。张亚茹等[30]人研究发现,不同浓度的低氘水均能抑制酪氨酸酶活性,但他们的研究主要侧重于不同ppm的低氘水对酪氨酸酶活性的影响。同时,Parvez S[31]和黄宝亮等[32]人研究发现,红参中的熊果苷和精氨酸双糖苷均能通过相应的作用机制抑制酪氨酸酶的活性。这表明低氘水和红参对酪氨酸酶活性均有抑制作用,与试验结果一致,但低氘水和红参共同使用是否存在协同作用还有待进一步探讨。

除了功效外,精华液的离心稳定性和pH值直接影响其品质。根据《化妆品通用检测法》,在3 000 r/min离心15 min未出现分层、浮油、变色等现象,即可表明精华液具有良好的离心稳定性,试验表明该精华液具有较好的离心稳定性,同时pH值为5.2,表明精华液温和无刺激。

化妆品接触性皮炎根据发病机制和诱因不同可以分为过敏性接触性皮炎(CACD)和刺激性接触性皮炎(CICD)。过敏性接触性皮炎(ACD)非常常见,约5人中就有1人发生[33]。目前报道中最常见引起CACD的过敏原主要有:香料、防腐剂、染料中的对苯二胺、表面活性剂等[34]。该试验中引起志愿者发生微弱红斑的可能是由青花香精、甘油或1,3-丁二醇引起的。虽然宋利萍[35]研究发现,红参对被动皮肤过敏反应和接触性皮炎具有抑制作用,但王智彪[36]也报道过相关红参过敏的案例,因此,也不排除志愿者可能对红参过敏。

综上所述,以红参提取物为原材料所制成的低氘水精华液质地均匀、性质稳定,温和无刺激,具有良好的美白功效,且契合目前对化妆品“天然”的要求,为消费者提供了一种天然健康护肤产品的生产可能。