紫玉兰叶总黄酮的提取工艺优化及对亚硝酸盐清除能力研究

陈健旋, 苏羽璇, 庄远红, 陈建福,3*

(1. 漳州职业技术学院 食品工程学院;2.闽南师范大学 生物科学与技术学院;3.福建省精细化工应用技术协同创新中心:福建 漳州 363000)

紫玉兰(MagnolialiliifloraDesr.)又名辛夷,为木兰科木本植物,其存于我国的栽培历史时间已达2千多年[1-2]。紫玉兰中含有多酚、黄酮、精油等许多具有抗微生物、抗炎、抗血小板、抗过敏作用的天然有效成分,正因这些独特的成分,紫玉兰常被用来治疗流鼻涕、头痛、鼻塞、风寒等症状[3],其中,黄酮是存在于植物体中具有2-苯基色原酮结构的化合物,具有抗炎、抑制细菌、降低人体血压、抗击外辐射、抗击癌症、增强人体免疫力等诸多作用,而且还具有防治人体心脑血管系统疾病和人体呼吸系统疾病的作用[4-5]。

超声波提取法是一种在超声波的机械效应、空化效应和热效应的共同作用下,促进并提高植物细胞壁的通透性,加速细胞吸水膨胀,强化细胞内容物与提取溶剂间的传质速率,加速细胞中活性成分溶出的一种新型提取方法[6-7]。响应面法是常用的工艺优化方法,是在实验数据的基础上,结合软件分析,采用多元二次回归方程来分析自变量对响应变量的影响,并以图形形式表达出拟合因素与响应值之间函数关系,可直观地呈现出各因素之间的交互性,从而实现实验参数预测的可靠性与准确度[8-9]。亚硝酸盐是一种可以保持食物的颜色和光泽的食品添加剂。适量的亚硝酸盐可以延长食物的储存时间,但过量的亚硝酸盐促进蛋白羰基和二硫键的形成,导致人体缺氧、头晕、昏迷甚至丧失生命。亚硝酸盐的清除主要依靠酸解、酶解和还原剂还原等[10]。研究表明,一些天然植物中的提取物可以与亚硝酸盐发生反应,从而消除或降低食物中的亚硝酸盐含量[11]。当前,对于紫玉兰的研究主要集中在栽培、观赏和组织培养上,对紫玉兰有效成分的提取研究较少。该研究以紫玉兰叶为原料,利用响应面法对紫玉兰叶总黄酮超声波辅助提取工艺进行优化并评价其对亚硝酸盐的清除能力,为紫玉兰资源开发成为亚硝酸盐清除剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

紫玉兰叶,采摘于漳州市马鞍山,清洗过后置于烘箱烘干,粉碎后封装置于阴凉干燥处,备用;乙醇为食品医药级;其余试剂均为市售分析纯。

分光光度计(UV-200),上海美普达仪器有限公司;超声波清洗器(KQ-100TDE),昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁为标准品测定总黄酮。以70%乙醇为溶剂,于100 mL容量瓶中溶解0.100 0 g芦丁标准品,定容后配成1.0 g/L的标准液。取5 mL标准液加入到50 mL容量瓶中,摇匀定容,配制出浓度为0.1 g/L 的芦丁母液。再分别从中取0.5、1、1.5、2、2.5和3 mL的芦丁母液到5支试管中,然后依次加入70%的乙醇直到5.0 mL,这时溶液的浓度是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06 g/L。继续加入0.3 mL 5%的NaNO3,摇匀后静置5 min,然后再加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3,摇匀静置6 min,继续加入2 mL 4%的NaOH,摇匀后继续添加70%乙醇直到10 mL,最后静置15 min。此时溶液的浓度为0.005、0.01、0.015、0.02、0.025和0.03 g/L。在紫外分光光度计的吸光度位于510 nm时,用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[12]进行比色。在510 nm下测其吸光值(A)。以OD510为纵坐标,对照品的浓度(g/L)为横坐标。通过线性拟合得到回归方程:y=10.451x+0.000 3,R2=0.999 4。

1.2.2 总黄酮提取率的测定

在100 mL圆底烧瓶中加入事先准备好的紫玉兰叶粉末1.00 g,再加入乙醇,超声波清洗器提前设好温度和时间,等到水温到达设定的温度后,开始提取。超声结束后,将圆底烧瓶取下,放入大烧杯中静置冷却,冷却后将提取液浓缩定容后再进行稀释,根据1.2.1的方法,测定其吸光值,计算总黄酮的提取率,具体计算公式如下:

式中,C为总黄酮的质量浓度(mg/L),V为稀释后的提取液体积(L),m为紫玉兰叶质量(g)。

1.2.3 单因素试验设计

固定基础工艺条件为超声温度65 ℃、液料比35 (mL∶g)、乙醇浓度60%和超声时间30 min,分别考察超声温度为55、60、65、70和75 ℃、液料比为25、30、35、40和45 (mL∶g)、乙醇浓度为40%、50%、60%、70%和80%和超声时间为10、20、30、40和50 min的条件下,获得的提取液,并按1.2.2的方法计算出提取率,以确定最佳的工艺条件。

1.2.4 响应面试验

根据所考察的单因素试验确定出各工艺条件对紫玉兰叶总黄酮提取率的最佳取值范围,然后在最佳取值范围内,进行Box-Benhnken试验设计和响应面优化,因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken响应面因素及水平Table1 Factors and Levels of Box-Behnken response surface

1.3 紫玉兰总黄酮亚硝酸盐的清除能力

在比色管中分别加入10.0 mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH值3.0)、1.0 mL NaNO2溶液(50 g/mL)和5 mL不同浓度的紫玉兰叶总黄酮溶液,设置水浴锅37 ℃保温1 h后分别加入2.0 mL对氨基苯磺酸(0.4%)和1.0 mL的盐酸萘乙二胺(0.2%),定容至25 mL,静置15 min,在540 nm处测得吸光度A,紫玉兰叶总黄酮溶液浓度为0时的吸光度为A0,并以Vc为对照,分别计算亚硝酸盐的清除率[13]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声温度对总黄酮提取率的影响

超声温度55～75 ℃中,65 ℃时的紫玉兰叶总黄酮提取率达到最大值(图1)。这是因为溶剂分子热运动与温度有关,超声温度较低时,分子热运动较小,叶片细胞壁两侧的渗透与扩散能力较小,导致总黄酮提取率低;而过高的超声温度会导致总黄酮中化学结构较不稳定的分子发生氧化[14-15]。因此,超声温度选择为65 ℃。

图1 超声温度对黄酮提取率的影响

2.1.2 液料比对总黄酮提取率的影响

液料比25～45 (mL∶g)中,35 (mL∶g)时的紫玉兰叶总黄酮提取率达到最大值(图2),这是因为总黄酮的溶出与提取溶剂的用量有关,溶剂与原料2个体系中的总黄酮之间存在一定的浓度差,产生溶出传质推动力,使得原料中的总黄酮向溶剂中扩散,液料比较小时,溶剂用量较少,溶剂中总黄酮含量与原料中总黄酮含量较快达到平衡,而溶剂用量较高时,推动力较大,可使更多的总黄酮溶出[16]。当溶剂用量过大时,在后续的浓缩等操作单元中,会增加总黄酮的损失,导致总黄酮提取率的下降。因此,液料比选择为35 (mL∶g)。

图2 液料比对黄酮提取率的影响

2.1.3 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

乙醇浓度40%～80%中,60%时的紫玉兰叶总黄酮提取率达到最大值(图3),这是因为提取溶剂的极性是由乙醇的浓度决定的,乙醇浓度较低时则溶剂中水含量较高,极性较大,与总黄酮的极性区别较大,总黄酮溶出率较低,而乙醇浓度较高时又会增加细胞内容物中脂溶性物质溶出与总黄酮竞争,溶剂被争夺[17]。因此,乙醇浓度选择为60%。

图3 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.1.4 超声时间对黄酮提取率的影响

超声时间10～50 min中,30 min时的紫玉兰叶总黄酮提取率达到最大值(图4),这是因为总黄酮从细胞壁渗透溶出需要一定的时间,当超声时间较短时,总黄酮还未完全溶出,提取率较小,而超声时间较长时,总黄酮在较长的超声时间内发生氧化而结构受损[18]。因此,超声时间选择为30 min。

图4 超声时间对黄酮提取率的影响

2.2 响应面试验的结果分析

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据2.1单因素试验的结果,设计4因素3水平的Box-Behnken试验,组成29个试验点进行(表2)。分析数据得到表3中各个自变量的交互作用对黄酮提取率的影响。

表2 响应面分析方案及结果

拟合表3的数据,可以得出紫玉兰叶中总黄酮提取率(Y)的回归模型为:Y=95.57-1.55A+0.78B+1.52C+0.50D+0.76AB+1.43AC+0.39AD-0.44BC-1.78BD- 1.52CD-3.83A2-1.31B2-2.34C2-3.25D2。

分析表3可知,模型的P<0.01,这说明该模型达到了极显著水平。回归系数R2=0.915 2,失拟度为0.147 4>0.05,表明拟合度好,并且响应值的改变有91.52%的可能与自变量的改变有关。根据F值大小可以推断出各因素对提取率的影响程度为:超声温度、乙醇浓度、液料比、超声时间。其中,一次项A、C和二次项A2、C2、D2的P值都小于0.01,说明所考察的这些项对紫玉兰叶总黄酮的提取率都有着极显著的影响,并且说明所考察的工艺条件对响应值的影响不是简单的线性关系。在以上综合分析的基础上可以看出,利用该二次回归方程模型对紫玉兰叶总黄酮的提取工艺进行分析与预测是可靠的。

表3 方差分析结果

2.2.2 因素间交互作用对黄酮提取率的影响

最优参数以及各参数之间的影响能通过响应面图表示出来。根据回归分析的结果,将任一因素看作是零水平,就可以得到其他2个因素交互作用的结果,并据此做出回归方程的响应面图形。响应面图的曲面越陡,等高线图的等密度线越密集,那么两因素交互作用的影响就越显著。等高线图可以直接体现出两因素交互作用的显著程度,如果两因素具有显著的交互作用,等高线即为椭圆,反之则为圆形。

由图5中可以看出,坡度最大的是液料比和超声时间这两者的响应面曲面,并且其等高线也最密,说明其交互作用对响应值的影响最为显著,陡峭程度和等高线密度排在第2的是乙醇浓度和超声时间。说明乙醇浓度和超声时间对响应值的影响显著性程度次之,用同样的方法分析可知,各自变量间交互作用对响应值影响程度的顺序为BD,CD,AC,AB,BC,AD。

2.2.3 最佳工艺条件的确定

通过对试验数据的分析可以得出,用超声波辅助法提取紫玉兰叶中黄酮类化合物的最优参数分别是超声温度64.36 ℃、液料比36.30 mL/g、乙醇浓度62.83%和超声时间29.32 min,此时的理论提取率为95.97 mg/g。为了便于操作,将条件修正为:超声温度64 ℃、液料比36 mL/g、乙醇浓度63%和超声时间29 min。在修正后的试验条件下做3组验证试验,得出提取率为95.72 mg/g。与预测值较为接近(相对误差0.26%),说明方程拟合度良好。响应面法可以优化紫玉兰叶黄酮的提取工艺。

图5 各工艺因素交互作用对提取率的影响

2.3 紫玉兰叶总黄酮对亚硝酸盐的清除能力

由图6可知,在所考察的浓度范围(1.0～6.0 mg/L),紫玉兰叶总黄酮对亚硝酸盐的清除率随着紫玉兰叶总黄酮浓度的增加而增大,当紫玉兰叶总黄酮浓度为3.0 mg/L时,对亚硝酸盐清除率已超过了50%,通过计算得到其对亚硝酸盐清除率的IC50为2.58 mg/L。当紫玉兰叶总黄酮为6.0 mg/L时,清除率已达到74.21%,表明紫玉兰叶总黄酮与亚硝酸盐清除率之间存在量效关系,紫玉兰叶总黄酮具有良好的亚硝酸盐清除率,但小于维生素C的清除率。

图6 维生C和紫玉兰叶总黄酮对亚硝酸盐的清除率

3 结论

该试验运用单因素试验和响应面法优化了紫玉兰叶总黄酮的提取工艺,通过Design expert 7.05b软件构建超声波辅助法提取紫玉兰叶总黄酮的数学回归模型。以该模型的回归方程及其等高线图为依据,研究4个因素及4个因素相互之间的作用对提取率的影响大小,结果为超声温度>乙醇浓度>液料比>超声时间。确定了最佳的工艺条件为:超声温度64 ℃、液料比36 (mL∶g)、乙醇浓度63%和超声时间29 min,此时的总黄酮提取率为95.72 mg/g。与预测值的误差仅有0.26%,说明该模型合理,预测可靠。紫玉兰叶具有良好的亚硝酸盐清除率,其与亚硝酸盐清除率之间存在量效关系,当紫玉兰叶总黄酮浓度为3.0 mg/L时,对亚硝酸盐的清除率已超过了50%,其IC50为2.58 mg/L;当紫玉兰叶总黄酮为6.0 mg/L时,清除率已达到74.21%,但小于维生素C的清除率,该研究能为紫玉兰叶黄酮类化合物的提取提供参考和理论依据。