多基原藏药普尔那抗炎活性成分比较研究

昂文索南,米 玛,陈 静

(西藏藏医药大学,西藏 拉萨 850000)

藏医药学作为我国传统医药的重要组成部分,距今已有3 500多年历史。经典古籍《四部医典》中记载了大量藏药材的性味功效、方剂配伍及使用禁忌等,对藏医药的传承与发展具有重要的学术价值和指导意义。由于藏医流派传承、药材生境差异及学者的认知不同,藏医临床对药材的辨认及入方选用存在差异,出现了“一名多药”即多基原现象。具有抗炎功效的常用藏药普尔那就属于多基原药,即藏医临床既使用菊科植物结血蒿,也使用唇形科植物川藏香茶菜。普尔那(ArtemisiavestitaWall.ex Bess.)又称普尔芒,系菊科植物结血蒿的地上部分,味苦、辛,气臭,性寒,具有清热解毒、消肿消炎、杀虫利湿、止血等功效。兴替那保(Rabdosiapseudo-irrorataC.Y.Wu)又名兴托里那保、兴替里、兴替那布、兴替纳博等,系唇形科植物香茶菜的地上部分,味甘,消化后味苦,藏医临床用于消炎、去眼翳障等[1-3]。

其实自然界中存在很多具有消炎作用的化学物质。通过查阅文献可知,苯丙素类、黄酮类化合物具有广泛的生物活性,已知苯丙素类的绿原酸[4-6]、黄酮类的芹菜素[7-9]抗炎活性明显。本研究采用高效液相色谱法,建立藏药普尔那中绿原酸、芹菜素的含量测定方法,通过比较含量差异,提出藏医临床消炎所用最优药材的选用建议,为藏药材的临床选择、质量标准制订提供数据支持。

1 藏药普尔那抗炎活性成分文献研究

通过查阅文献资料发现,藏药普尔那在藏医临床中常用于消炎止痛,对驱虫与破伤风等细菌感染也有一定疗效。临床常用普尔那制剂汇总,见表1。

表1 普尔那相关成方制剂功效及用法

2 仪器与材料

高效液相色谱仪(E2695型,2485 型紫外检测器,2998 型二极管阵列检测器,WATERS公司);超声波清洗机(SB 5200DT,宁波新芝生物技术股份有限公司);电子天平(ME204型,METTLER TOLEDO);粉碎机(A11 basic型,IKA公司)。

实验用拉萨普尔那采自西藏拉萨夺底沟,康区普尔那购于西藏昌都。此2种药材均经西藏自治区药材鉴定专家嘠务教授鉴定确认,其中拉萨普尔那为结血蒿,康区普尔那为川藏香茶菜。

甲醇、乙腈为色谱纯(进口),其他试剂均为分析纯;超纯水(MILLI-Q,ADVANTAGE A10);绿原酸对照品(CAS NO 327-97-9),成都康邦生物技术有限公司;芹菜素对照品(CAS NO 520-36-5),成都康邦生物技术有限公司;高效液相色谱仪(E2695型,2485 型紫外检测器,WATERS公司);超声波清洗机(SB 5200DT,宁波新芝生物技术股份有限公司);电子天平(ME204型,METTLER TOLEDO);粉碎机(A11 basic型,IKA公司)。

3 方法与结果

3.1 绿原酸测定方法与结果

3.1.1 色谱条件 Agilent Zorbax C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈-0.1% 磷酸水溶液(15∶85)为流动相;柱温 30℃;流速为 1.0mL/min;检测波长为 489nm;进样量为 10μL;理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于3 000。结果见图1。

注:A.绿原酸对照品;B.结血蒿茎;C.结血蒿叶;D.川藏香茶菜茎;E.川藏香茶菜叶。

3.1.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品0.002 0g,置于10mL 量瓶中,加甲醇定容,制成0.2mg/mL 溶液,作为对照品溶液储备液。

3.1.3 供试品溶液的制备 取药材适量,粉碎,取 1g 精密称定,置于25mL 容量瓶中,加75% 乙醇,静置过夜,80℃ 加热超声处理2h,放冷,加75% 乙醇至刻度,摇匀,经微孔滤膜(0.45μm)滤过,作为供试品溶液。

3.1.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液储备液0.25、0.4、1、2、3、6、10mL 于比色管中,甲醇定容。标准系列绿原酸含量分别为5、8、20、40、60、120、200μg/mL。以峰面积为横坐标、绿原酸含量(μg)为纵坐标,绘制标准曲线,计算得到回归方程:Y=48 440X-65 244,R2=0.999 5,表明在5～200μg/mL 范围内具有良好的线性关系。

3.1.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液10μL,重复进样7次,测得峰面积RSD=0.32%,表明系统有良好的精密度。

3.1.6 重复性实验 精密称取药材粉末(过四号筛),按供试品溶液制备方法,平行制得7份供试品溶液后,测定,计算RSD=1.74%,表明本方法有良好的重复性。

3.1.7 稳定性实验 取同一供试品溶液,分别于配置后 0、2、4、8、12、16、18h,注入高效液相色谱仪中,记录峰面积,RSD=2.36%,表明供试品溶液在18h内稳定。

3.1.8 加样回收实验 精密称取已测定含量的川藏香茶菜叶1.000 0g,称定6份,分成3组,每组分别加入400μg/mL浓度的对照品溶液0.2、0.3、0.5mL,甲醇定容至25mL容量瓶中,按“3.1.3”项下条件制备加样回收供试品溶液,并注入高效液相色谱仪中进行测定,计算平均回收率为91.26%,表明加样回收效果较好。见表2。

3.1.9 样品含量测定 按上述色谱条件对供试品溶液进行测定,测得药材中绿原酸的含量。见表3。

表3 藏药普尔那中绿原酸的含量 (μg/g)

3.2 芹菜素测定方法与结果

3.2.1 色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);以甲醇-0.1%磷酸水溶液(60∶40)为流动相;柱温30℃;流速为1.0mL/min;检测波长为350nm;进样量为10μL;理论塔板数按芹菜素峰计算应不低于3 000。结果见图2。

3.2.2 对照品溶液的制备 精密称取芹菜素对照品0.006 0g,置于10mL量瓶中,加甲醇定容,制成0.6mg/mL溶液,作为对照品溶液储备液。

3.2.3 供试品溶液的制备 同“3.1.3”项下操作。

3.2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液储备液0.025、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mL于比色管中,甲醇定容。标准系列芹菜素含量分别为1.5、6、12、18、24、30、60μg/mL。以峰面积为横坐标,芹菜素含量(μg)为纵坐标,绘制标准曲线,计算得到回归方程:Y=19 986X-5 571.9,R2=0.999 7,表明在1.5～60μg/mL范围内具有良好的线性关系。

3.2.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液10μL,重复进样7次,测得峰面积RSD=0.61%,表明系统有良好的精密度。

注:A.芹菜素对照品;B.结血蒿茎;C.结血蒿叶;D.川藏香茶菜茎;E.川藏香茶菜叶。

3.2.6 重复性实验 精密称取药材粉末(过四号筛)适量,按供试品溶液制备方法,平行制得7份供试品溶液后,测定,计算RSD=2.62%,表明本方法有良好的重复性。

3.2.7 稳定性实验 取同一供试品溶液,分别于配置后0、2、4、6、11、15、20h,注入高效液相色谱仪中,记录峰面积,RSD=2.99%,表明供试品溶液在20h内稳定。

3.2.8 加样回收实验 精密称取已测定含量的川藏香茶菜叶1.000 0g,称定6份,分成3组,每组分别加入浓度为0.3mg/mL的对照品溶液0.2、0.3、0.6mL,甲醇定容至25mL 容量瓶中,按“2.1.3”项下条件制备加样回收供试品溶液,并注入高效液相色谱仪中测定,计算平均回收率为94.03%,表明加样回收效果较好。

表4 芹菜素加样回收率 (n=6)

3.2.9 样品含量测定 按上述色谱条件对供试品溶液进行测定,测得药材中芹菜素的含量。见表5。

表5 藏药普尔那中芹菜素的含量 (μg/g)

4 讨论

4.1 含量测定指标选择

藏药普尔那是临床常用广谱抗炎药,近年来更被作为麝香的代用品入方剂使用。本研究在选择含量测定指标时,重点考察了具有抗炎活性的化学成分。植物中的苯丙素类、黄酮类化合物具有广泛生物活性。通过查阅文献发现,已有大量关于绿原酸、芹菜素抗炎活性研究的文献报道,故而选择该2种化学成分作为多基原普尔那抗炎活性比较研究的含量测定对象。

绿原酸(chlorogenic acid)是苯丙素类化合物,具有较广泛的消炎作用,已知具有抗炎[4-6]、抗菌[13]、抗肿瘤[14]、抗氧化[15-16]、提高免疫力[17]、减轻肺损伤[18-19]、缓解神经损伤[20]等多种生物活性。

芹菜素(apigenin)又称芹黄素、洋芹素,是黄酮类化合物。国内外大量研究发现,芹菜素具有抗炎[7-9]、抗菌[21]、抗病毒[22]、抗肿瘤[23-24]、提高免疫力[25]、抗氧化[26]、治疗糖尿病[27]等多种生物活性。

4.2 抗炎活性检测结果

4.2.1 绿原酸含量 结血蒿中绿原酸的含量约为川藏香茶菜的19倍,其在茎中的含量为1 404.33μg/g,约为川藏香茶菜的16倍;在叶中的含量为1 338.61μg/g,约为川藏香茶菜的23倍;且此2种药材茎中有效物质的含量均高于叶中的含量。

4.2.2 芹菜素含量 结血蒿叶中芹菜素的含量约为川藏香茶菜的200倍,其叶中的含量为1 040.24μg/g,是茎含量的8倍;川藏香茶菜茎中则未检测出该成分。

4.2.3 抗炎活性分析 与川藏香茶菜相比,结血蒿中绿原酸、芹菜素的含量更高,推测其抗炎活性可能更好。该检测结果与藏医临床用于消炎、杀虫时多选用结血蒿,而治疗眼疾则用川藏香茶菜的药材选择规律相符合。实验发现,结血蒿茎、叶中的成分含量存在较大差异,即绿原酸的含量为茎多于叶,芹菜素的含量为叶多于茎。由于不同活性成分在同一药材的不同药用部位中的含量存在差异,这可能是结血蒿入药部位为地上部分的原因。

多基原藏药现象为药材的入药选择、道地产地的确定带来了难度,应深入开展藏药材的质量标准研究,探究藏药的活性成分和作用机制,为多基原藏药的临床选药、合理用药提供依据。