基于质谱成像可视化表征甘草饮片主要化学成分组织分布

熊田田,罗世英,裴照卿,唐 策,3*

(1.成都中医药大学 药学院,四川 成都 611137;2.成都中医药大学 中医药创新研究院,四川 成都 611137;3.成都中医药大学 民族医药学院,四川 成都 611137)

甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、胀果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根茎,具有补脾益气、祛痰止咳、清热解毒、缓急止痛、调和诸药的功效[1-2]。《神农本草经》将甘草列为上品,在中药组方中常配伍使用,起到调和药性的作用,素有“十方九草”之美誉。甘草主要包括甘草素等黄酮类、甘草酸等皂苷类、香豆素类、多糖类等成分,其中黄酮类和皂苷类含量较高[3]。现代药理学研究表明,甘草具有抗氧化、抗癌、神经保护、镇咳、抗抑郁等多种药理活性。

甘草化学成分较多且成分复杂,目前关于甘草成分定性、定量分析研究主要为高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)、超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(UPLC-QQQ-MS)等,质量评价多侧重于多个成分的含量测定。尽管甘草在植物化学和药理作用等方面已有较多研究,但其在空间代谢物的报道还较少,因为采用上述方法打粉提取后,其空间代谢物相关信息被破坏或丢失。质谱成像(Mass spectrometry Imaging,MSI)技术是一种基于质谱分析,对待测样品进行多点检测、多维数据获取及可视化,实现多分子水平、多分子种类、高灵敏度同时检测并显示其空间分布的分子成像技术,不需要基质涂抹的常压原位电离质谱分析技术,可通过特定成像软件进行质谱数据分析,从而清晰直观地反映出待测分子在天然药物中的组织分布。质谱成像技术既操作简便、又保证了被分析物的原位空间性和准确性,已广泛应用于医药、工业、食品、生物学等行业[4-6]。

本研究采用具有实时、在线、原位、高通量等特点的解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)技术,对甘草饮片中的化学成分进行快速、全面的定性分析,对甘草根茎主要化学成分组织分布,进行100μm的空间分辨率可视化表征,为甘草次生代谢产物的生物合成和积累提供重要信息。

1 仪器与试药

Waters Snapt QTof质谱仪(美国Waters公司);DESI-MSI质谱成像系统(美国Waters公司);移液枪(美国Thermo Scientific公司)。HPLC级甲醇(美国Sigma-Aldrich公司),HPLC级甲酸(美国Thermo Fisher 公司),亮氨酸脑啡肽(美国Waters公司),Milli-Q纯净水。药材收集于四川省成都市荷花池药材市场,经唐策副教授鉴定为甘草GlycyrrhizaeRadixetRhizoma的根及根茎。

2 方法

2.1 供试品DESI-MSI分析

在具有解析电喷雾的SNAPT TOf质谱仪上,扫描收集甘草的化学成分。通过高电压加于N2辅助的电喷雾溶剂上形成带电喷雾液滴,并直接喷射于样品上,带电溶剂与待分析物作用发生离子化,形成二次带电液滴,在表面收集离子和中性分子,最后转移至质谱检测器创建质谱图像,并构建2D图像。使用高清晰度成像(HDI)软件创建图像,参数设置如下:X和Y像素大小为100μm;光栅速度300μm/s;喷雾溶剂由90%甲醇、10%水、0.05%甲酸和0.1mmol/L亮氨酸脑啡肽组成,溶剂流速为2μL/min,在负离子模式下进行质谱扫描,毛细管电压4.5kV,锥孔电压80V,m/z100-1 600。以产生原始MS文件创建MS图像,LE(m/z554.2615)用于校正高分辨率。

2.2 数据处理

将MS原始数据文件导入HDI V1.5软件(美国Waters公司)查看图像。通过数据库查找有关甘草化学成分的文献获得有关成分化学名及分子式,运用Mass Lynx V4.2(美国Waters公司)计算相对质量及质谱所得的离子碎片相对质量与计算得出的相对质量偏差进行鉴定。

3 结果

对鉴定出的甘草主要成分组织分布可视化图像进行分类归纳,其中,黄酮类22种、三萜类5种和其他类1种,甘草根茎组织横切面分为皮层、韧皮部、形成层、木质部、髓部5个部位,见表1和图1。

表1 甘草主要化学成分

3.1 黄酮类成分在甘草横切面的空间分布

对比分析甘草根茎中主要黄酮类成分的图像,按如下方法鉴定了22种主要成分。m/z549.162 0经过Mass Lynx V4.2软件拟合得出分子式为C26H29O13,其中ppm为2.2,结合离子信号强度和所建成分数据库推测图m/z549.162 0是成分芹糖甘草苷/芹糖异甘草苷(21)的组织分布图,其余成分同理推测。

经归纳总结出,甘草素/异甘草素(2)在形成层和髓部分布较多,韧皮部和木质部次之;怀特酮/黄甘草异黄酮(8)、甘草异黄酮乙(11)、异甘草黄酮醇(12)、甘草香豆素(15)、新乌拉尔醇/乌拉尔醇(16)、Kanzonol(17)、甘草利酮(18)芹糖甘草苷/芹糖异甘草苷(21)主要分布在韧皮部和木质部,在髓部几乎无分布;高紫柳查尔酮(5)、红车轴草素/异山柰素(6)、光甘草酮/异光甘草酮(7)、甘草查耳酮A/C/E/4′-O-甲基光甘草定(9)、Corylifol B(10)、3-羟基光甘草酚/胀果甘草宁A(19)分布不均匀;Angustone A/Isoangustone A(20)在髓部几乎无分布,在皮层分布较多,其余部位分布均匀;异佛莱心苷(22)主要分布于韧皮部、木质部、髓部,在形成层几乎无分布。

成分熊竹素B(1)、三羟基异黄酮(3)、柚皮素查尔酮(4)、粗毛甘草素C(13)、Hirtellanine I(14)含量极少,离子信号较弱,为了使成分分布更清晰可观,可以将最大信号强度再调小一些。

3.2 三萜类成分在甘草横切面的空间分布

对比分析甘草根茎中主要三萜类成分的图像,鉴定了5种主要成分。成分m/z821.398 4经过Mass Lynx V4.2软件拟合得出分子式为C42H61O16,其中,ppm为2.9,结合离子信号强度和所建成分数据库推测图m/z821.398 4是成分甘草酸/乌拉尔甘草皂苷B/甘草皂苷H2/K2(24)的组织分布图。成分甘草皂苷B2(23)、甘草酸/乌拉尔甘草皂苷B(24)、甘草皂苷J2(25)、甘草皂苷G/羟基甘草酸(26)、甘草皂苷A3(27)主要分布在韧皮部和木质部,形成层和髓部分布次之。

图1 甘草主要化学成分成像

3.3 其他类成分甘草横切面的空间分布

对比分析甘草根茎中主要其他类成分的图像,鉴定了1种主要成分Glicophenone(28),其含量较少,在髓部几乎没有分布,其余部位分布不均匀。

4 讨论

尽管DESI-MSI出现时间不长,但近年来其在植物成分分析方面的应用证实,DESI-MSI在植物成分空间分布的研究前景广阔,如钩藤三种生物碱分布研究,运用此技术对不同生长阶段钩吻植物不同部位的成分分布进行成像分析[9];红果樫木种子生物碱分布研究,运用此技术对红果樫木种子进行成像分析,得出发育过程黄酮类生物碱积累的动态规律[10];附子的成分分布研究,运用此技术对附子生品和加工品进行成像分析,得出不同蒸制时间点的化学成分分布规律[11]等。

甘草中成分复杂,其成分常含有大量同分异构体,本研究仅对样本的一级结构进行了分析,同分异构体对分析结果存在一定影响。部分成分在样本上分布不均匀,影响了分析结果的直观性,而LI等[12]对甘草质谱成像的研究则证明质谱成像技术在甘草根茎成分分布研究的可行性。

本研究运用DESI-MSI技术对甘草根茎主要化学成分的空间分布进行了研究,共鉴定出28种化学成分,并对其在皮部、髓部等不同微区的分布进行了成像,得到了28种化学成分的组织分布情况。甘草黄酮类成分具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抑菌、保肝等作用,其治疗心脏疾病、糖尿病等也具有一定药用价值,近年来其更是在各类护肤品中有所应用[13-14],甘草三萜类成分也有抗氧化作用[15]。不同成分对人体作用不同,各类成分在空间上的分布规律有利于目标成分研究。对甘草根茎中成分的空间位置进行成像研究,不仅有利于理解、掌握甘草中特定成分的分布规律和体内生物合成,还可结合甘草代谢物在动物组织切片中的分布,明确药效成分及作用靶点,亦可以对甘草炮制前后的成分变化进行分析,找出增效减毒最大化的炮制方法。本研究为甘草主要化学成分空间分析提供了新信息,对豆科植物黄酮和皂苷的生物合成途径研究可资借鉴,进一步证明该技术可为植物中代谢物进行高通量分析提供新方法,且DESI-MSI对甘草成分的空间成像分析,也为其他中药材研究提供了参考和技术支撑,应用前景广阔。