药用全蝎毒液的蛋白差异分析

卫秋阳,邓小书,竭 航,鲁增辉,石 萍,陈仕江*

(1.重庆市中药研究院,重庆 400065;2.重庆市药物种植研究所,重庆 408435)

全蝎,味辛、性平,归肝经[1],是我国传统名贵药材,有悠久的用药历史,最早可追溯至五代时期的《蜀本草》,其中便有全蝎入药的记载,历代医家皆言其走窜之力迅速,能走窜四肢、搜尽一身之风邪,并能引诸药达病所,为治风要药[2]。目前,在临床上全蝎也常用于治疗惊痫抽搐、风湿痹痛、疮疡肿痛等病症,也是中医平肝熄风的常用药物[3]。

目前,全世界有蝎子1 000余种,在我国仅有十余种分布,其中记录有药用价值的全蝎种类就包括东亚钳蝎、条斑钳蝎、海南双针蝎、大理石纹狼蝎、中华狼蝎、藏蝎、辽克尔蝎、木蝎等[4-6]。但在历版《中华人民共和国药典》中仅记载东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch为中药全蝎的唯一基原,相关药理活性研究也以东亚钳蝎为主,而对于市面上所流通的其他药蝎种类,以及这些药蝎所含有效成分的差异,则研究较少[7]。

正是由于目前药用全蝎的经济价值和药用价值极高,野生资源被大量捕捉,随着城镇乡村房屋大量翻新改建,严重破坏了野生蝎子的生存环境[8],加之市场上少数药贩趁机将其他药蝎混杂其中,从中牟取暴利,导致药蝎市场鱼龙混杂。为此,本团队从全蝎道地产区、养殖基地以及药材市场收集药用全蝎样品,在明确其种类的基础之上,评价各样品的毒囊特征以及蛋白成分,分析各地蝎子中的毒液成分差异,为全蝎优质品种发掘、毒液药效成分差异研究以及动物药资源的开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究所采集的活体蝎子均购买自全蝎养殖基地或药材收购商,样品收集地点分别为山东沂水县、安徽亳州市、河北邯郸市,收集活体蝎子后立即置于75%酒精溶液内保存带回。

1.2 仪器与试剂

试剂:北京聚合美生物科技公司M5 HiPer Universal DNA Kit试剂盒,南京建成生物工程研究所(总蛋白定量测定试剂盒,A045-4-2),2X M5 HiPer Taq HiFi PCR mix (with blue dye) 蓝色高保真Taq(MF002-05),默克Sigma-Aldrich Lysis buffer(MFCD01779855)。

仪器:Tarzan 96 梯度PCR仪(MP60201,武汉莫纳生物),SZ61-SET体视显微镜(日本,奥林巴斯),HBS-Scan全波长酶标分析仪(南京德铁),液相质谱LC-MS-9030(日本岛津)。

1.3 基原种类鉴定

运用线粒体基因检测技术分别提取、扩增各蝎子样品的DNA,DNA提取方法参照北京聚合美M5 HiPer Universal DNA Kit说明书进行,提取好的DNA经PCR程序(95℃,2min,95℃,35s,55℃,35s,72℃,35s,72℃,2min,×35 cycle,4℃,10min)扩增,扩增上下游引物分别为LCCO1490/LCO2198:‘5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG/TAAACT- TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’,扩增产物经电泳检测后送公司测序,结合NCBI数据库比对后确定其基原种类。

1.4 毒囊理化性质评价

对收集获得的蝎子样品分别进行拍照与蛋白质含量测定,拍照所需样品均为刚蜕皮的6龄蝎子,剪取蝎尾毒囊腺拍照并按照十字交叉法测量毒囊尺寸大小。总蛋白含量测定则是剪取毒囊0.1g,液氮速冻后加入0.9mL缓冲液研磨至匀浆,参照考马斯亮蓝法测定样品总蛋白含量,每组重复3次。

1.5 毒囊蛋白提取与活性成分鉴定

解剖获得各个蝎子的毒囊组织,用液氮充分研磨后加入Lysis buffer(裂解液∶蛋白酶抑制剂50∶1),涡旋溶解混匀,超声1s,停1s,累计120s,14 000g离心20min,取上清,分装,留取10μL定量。

采用Bradford法测定提取的蛋白浓度。先将样本用Lysis buffer 进行一定倍数稀释,使其终浓度落在标曲范围内,稀释好的样本和标准品(将BSA用Lysis buffer溶解成系列浓度的标准蛋白)各取10μL分别和300μL蛋白定量染料避光反应10min,用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值,根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线,然后计算样本浓度,在明确各样本的蛋白浓度后准备进行上机检测。蛋白样品检测运用label-free质谱技术进行iTRAQ蛋白定性定量分析,随后对检测结果进行差异分析与功能注释分析。

1.6 数据分析

2 结果与分析

2.1 基原种类鉴定

通过COI基因检测明确样品的基原种类,鉴定出的样品均属钳蝎科,其中安徽采集的样品属于细尖狼蝎(Lychasmucronatus),采集自河北的样品基原为条纹木蝎(Centruroidesvittatus),仅有山东收集的全蝎基原是《药典》规定的东亚钳蝎(Buthusmartensii)。见图1。

2.2 毒囊理化性质评价

不同地区采集样品的毒囊形态存在较大差异(图2A),其中细尖狼蝎的毒囊末端除去尾针以外还具有一刺突结构,而其余均为单一尾针结构(图2B)。就毒囊的大小来看,东亚钳蝎(SD)的毒囊尺寸最大(422.87μm×293.74μm),条纹木蝎(HB)全蝎的毒囊尺寸最小(383.00μm×209.92μm),而细尖狼蝎(AH)的毒针最长,达到434.71μm(见表1)。通过对毒囊组织内部的总蛋白含量进行测定,同样是东亚钳蝎的蛋白含量最高( 见图3),为(7 601.6±432.3)μg/mL(F2,6=6.532,P=0.031 2),而条纹木蝎的蛋白含量最低,仅为(4 456.3±675.2)μg/mL。

图1 全蝎基原鉴定

注:A:毒囊组织;B:毒囊负染。

表1 全蝎毒囊尺寸 (μm)

图3 毒囊总蛋白含量测定

2.3 毒液蛋白鉴定

对样品毒囊中的蛋白成分进行鉴定,发现不同采样地区的样品差异较大,各自聚成一类(图4A),注释获得的钳蝎科蛋白有482种(图4B)。对蛋白功能的注释表明,多数蛋白与修饰、转运相关(8%～21.62%),其次为参与氨基酸转运与代谢相关的蛋白(4%～10.81%),而与细胞外结构、骨架、细胞膜生物合成、细胞分裂相关蛋白最少(1%～2.7%),且并未注释到与核酸、染色质加工、修饰相关的蛋白(图4C)。

注:A:主成分分析;B:蛋白差异韦恩图;C:蛋白功能注释。

2.4 毒液差异蛋白分析

通过对蛋白功能进行富集分析,发现差异蛋白所富集的通路主要集中在磷脂酰肌醇信号系统和嘧啶代谢相关通路,而与碳代谢相关的通路富集度最低(图5A)。通过进一步对样品内高表达的蛋白种类进行分析,条纹木蝎仅在葡聚糖磷酸化酶系(Protein ID:T1K925)存在较高表达,而其余样品则在与三羧酸循环相关的丝氨酸蛋白酶(Protein ID:F1CIY2)、二氢硫辛酸琥珀酰转移酶(Protein ID:A0A3S3PEV5)具有较高表达(图5B)。

注:A:差异通路富集;B:蛋白表达热图。

2.5 毒液蛋白表达量检测

检测发现样品中毒液蛋白种类差异不大,但是其相对表达量却存在较大差异。进一步对蝎毒中抗癫痫、镇痛类有效成分进行比较,东亚钳蝎中Na+、K+毒素肽类物质、神经毒素类物质含量相对较高,如K+通道阻滞剂、Na+通道毒素(NaTx2)、钠毒素肽(BmKTb)以及神经毒素(BmK22)均具有较高表达。然而在条纹木蝎样品中,与Na+、K+相关的毒素肽类物质表达量最低,仅对Ca2+毒素肽与部分神经毒素存在较高表达(图6A)。此外,与之相对应的离子转运蛋白含量也存在相同的表达趋势,就东亚钳蝎而言,其钠/钾离子泵、钠/钾转运蛋白表达量最高,在171～180μg/mL之间,而条纹木蝎中的钙调素与钙转运蛋白也同样表达最高,为182～188μg/mL(图6B)。

注:A:毒液成分蛋白;B:离子转运蛋白。

3 讨论

全蝎作为一种传统名贵动物药材,入肝祛风,具有熄风镇痉、通络止痛、攻毒散结等功效,经现代医学研究证实,具有药用价值的蝎子种类仅有50余种,且基本属于钳蝎科[9]。但是,根据历版《药典》之规定,仅收录东亚钳蝎B.martensiiKarsch为全蝎类药材的唯一基原种类,主要分布于山东、河北、河南、安徽、湖北等地。然而,随着市场需求的不断扩增,野生资源遭受破坏,市场价格逐年攀升,导致部分商贩引进国外优势蝎种混杂其中。在这之中,细尖狼蝎、条纹木蝎就分别属于东南亚和美洲的优势蝎种,该类蝎子具有食性宽、易饲养的优势,也是当地重要的药食两用蝎种[10]。目前,在国内也不能排除部分养殖基地为谋求利益,或曾开展过引种养殖工作。

蝎毒是蝎子发挥毒性与药效的物质基础,也是评价其药用价值的重要指标。通过对毒囊蛋白成分鉴定发现,即使蝎子种类不同,毒液中均富含酶类物质,且大多与三羧酸循环的下游通路相关。而三羧酸循环作为三大物质代谢的枢纽,更是合成蝎毒相关酶系的必要前提[11]。在毒液中,蛋白酶的合成均来自于糖类物质氧化,经三羧酸循环生成α酮戊二酸、丙酮酸和草酰乙酸等,再与氨结合后转变成相应的氨基酸[12]。在该途径中,可合成磷脂酶、乙酰胆碱酯酶、磷酸化酶等酶系在内的复合酶蛋白,通常无毒,但是能够在细胞间发生水解反应,促进细胞溶解,是促进蝎毒进入胞内的必要前提[13]。

在蝎毒中,除了酶蛋白以外,另一大类含毒成分则被统称为毒性蛋白,是引起个体死亡和麻痹的主要成分,同时,毒液中含有的钠、钾离子等多肽类物质也是治疗惊痫抽搐、风湿痹痛的有效成分,通常是由20～80个氨基酸及3～4对二硫键组成,主要作用于Na+、K+或Ca2+通道[14]。现代药理研究也指出东亚钳蝎中所含有的Na+毒素肽(BmK),通过与人Nav1.7(hNav1.7)结合,可对革兰氏阴性菌感染、肿瘤细胞增殖、心功能不全或脑缺血再灌注引起的心脑血管疾病产生较好的抑制作用;同时Na+毒素肽还可抑制皮质神经元中钠通道的峰值电流,阻断脑神经元的过度兴奋性,从而发挥出抗癫痫活性[4,5,15]。

针对毒液的检测结果也进一步表明,东亚钳蝎作为《药典》规定品种,毒囊中的蛋白浓度最高可达7 601.6μg/mL,而其中与药效相关的钠钾泵、钠/钾转运蛋白浓度同样最高,分别达到171μg/mL和180μg/mL,这些离子调控蛋白能够参与钠离子和钾离子之间的交换,不仅对维持细胞电位、传递神经冲动信号具有重要意义[16-17],还会对神经、肌肉和心血管疾病的干预具有积极作用[18]。然而在细尖狼蝎或木蝎样品中,与Na+、K+通道阻滞剂相关的蛋白呈现出较低表达甚至缺失,相关药理活性尚未得到验证,贸然使用仍会存在一定风险[19]。

因此,本研究证实东亚钳蝎作为《药典》唯一收录品种,相比于其他蝎种,其毒液蛋白中的有效成分与含量均为最优,是全蝎药材的优质基原种类。此外,利用东亚钳蝎体内的天然蝎毒治疗离子通道相关疾病以及新药的研发也同样具有极高的应用前景。