广西人群miR-30基因rs16827546C/T和rs10095483A/C多态性分布特征及其与血脂水平的关系

韦叶生 罗艳萍 刘潮 谷嬉嬉 王腾 曾志能 蓝艳

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是由人类基因组编码的单链非编码小RNA分子，近年来逐渐被人们发现，其长约22 个核苷酸，是人类基因组的重要组成部分，在真核细胞中广泛存在。miRNA参与基因表达调控的多个方面，它们通过靶向作用mRNA使mRNA不稳定、抑制蛋白质产生或抑制靶基因翻译，在基因表达的转录后调控中发挥关键作用［1］。近年来，心脑血管疾病的发病率和死亡率在全球范围内呈急剧上升趋势，然而其发病机制尚未完全阐明，可能与基因组背景、生活方式、环境因素、血脂水平的改变以及它们之间的相互作用有关，其中血脂水平的改变是心脑血管疾病发病的重要病理基础［2-3］。因此，研究miRNA 在血脂调控中的潜在分子机制有助于预防以血脂异常为发病基础的心脑血管疾病的发生。miR-30基因已被证实为参与血脂调控的关键调节因子，并且可以在血浆中稳定测定［4］，然而，国内外鲜见关于miR-30基因遗传多态性以及其多态性与血脂关系的报道。因此，本研究采用SNPscan 技术分析广西人群miR-30基因簇位点rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 的遗传多态性特征，并与人类基因组计划（HapMap）公布的不同地区、不同人群的基因多态性分型数据进行比较，以探究其在不同地区、不同种族人群中的分布差异，并进一步探讨其与血脂的关系，为构建我国人群的基因多态性数据库以及早期预防和控制血脂提供参考资料，同时也可为今后研究miR-30基因多态性相关疾病以及群体遗传学研究奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象

随机选取2020 年9 月至2021 年7 月到桂林医学院附属医院体检的志愿者289 例，其中男性167例，女122 例，年龄在23～72 岁。排除自身免疫性疾病、心血管、脑血管和器质性疾病，各临床检查及实验室指标正常，均为健康无亲缘关系的独立个体。本研究在院伦理委员会批准下进行，所有志愿者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取

使用北京天根生化科技有限公司血液基因组DNA 提取试剂盒（批号：DP348-03，规格：200preps）提取基因组DNA 进行分装并冷冻储存（-70℃）备用。

1.2.2 引物的设计与合成

登录NCBI 查询miR-30基因rs16827546 和rs10095483 的DNA 序列，引物序列的设计采用Premier 3.0 在线软件进行设计，引物序列的设计由上海天昊生物科技有限公司公司完成。引物序列：rs16827546 C/T，上游：TTTTCTGGAACGTGGCAAACTT，下游：ATCTGCGGAGTGGAGACTGTTC，rs10095483 A/C：上游：CCAACTACCAAACAAGGGCATTC，下游：CTCCCAGAGAAAAAG TGTGTTAATTG

1.2.3 连接和多重PCR 反应及基因分型检测

1.2.3.1 连接反应 连接反应按以下程序运行：94℃1 min，58℃4 h，循环4 次，94℃2 min，72℃forever。

1.2.3.2 多重荧光PCR 反应 反应总体积为20 μL，PCR 扩增按以下程序进行：96℃1 min，94℃20 s，60℃40 s（每个循环降低0.5℃），72℃2 min，循环9 次；94℃20 s，57℃40 s，72℃1.5 min，循环25 次；68℃60 min；4℃forever。

1.2.3.3 基因分型检测 将多重PCR 产物10 倍dd H2O 稀释，振荡混匀，取1.0 μL PCR 产物与1 μL LIZ500+8.9 μL Hi-Di 混匀，95℃变性5 min 后ABI3730XL 测序仪检测，GeneMapper 4.1 分析原始数据。

1.2.3.4 数据分析与比较 分析289 例广西人群miR-30基因rs16827546 和rs10095483 的测序结果，直接法计算两位点基因型和等位基因频率，并与NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的人类基因组计划（HapMap）的欧州人（CEU）、日本人（JPT）、约鲁巴人（YRI）、意大利人（TSI）和北京汉族人（HCB）人群的SNP 分型数据进行比较分析。

1.2.4 血脂水平检测

受试者空腹8 h 以上，于次日清晨采集静脉血3 mL，分离收集血浆，生化分析仪分析总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycer-ide，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析数据；两位点的基因型和等位基因频率的分布用χ2检验进行分析；正态分布的计量资料用（）表示，行t检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 两位点基因分型检测结果

分型结果显示rs16827546 C/T存在CC（86.2%）、CT（13.8%）两种基因型。rs10095483 A/C 位点存在AA（89.3%）、AC（10.7%）两种基因型。见图1、2。

图1 miR-30 基因簇rs16827546 位点测序图Figure 1 The sequencing map of miR-30 gene rs1682754

2.2 广西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 位点多态性在不同性别间的分布

广西人群miR-30基因rs16827546 C/T 基因型以CC（86.2%）多见；rs10095483 A/C 基因型以AA（89.3%）多见，两位点的基因型和等位基因频率在男女性别间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 广西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 基因型和等位基因频率的比较［n（%）］Table 1 Comparison of rs16827546 and rs10095483 of miR-30 gene of Guangxi populationin in different genders［n（%）］

图2 miR-30 基因rs10095483 位点测序图Figure 2 The sequencing map of miR-30 gene rs10095483

2.3 广西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 两位点多态性与其他人群间的比较

广西人群两位点基因型和等位基因频率与HanpMap 计划公布的CEU、YRI 和TSI 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；广西人群rs16827546 基因型和等位基因频率与与JPT 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；广西人群两位点基因型和等位基因频率与HCB 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、表3。

表2 广西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 基因型和等位基因频率与不同地区人群的比较［n（%）］Table 2 Comparison of rs16827546 C/T genotypes and allele frequencies of miR-30 gene of Guangxi population in different regions［n（%）］

表3 广西人群miR-30 基因rs10095483 A/C 基因型和等位基因频率与不同地区人群的比较［n（%）］Table 3 Comparison of rs10095483 A/Cgenotypes and allele frequencies of miR-30 gene of Guangxi population in different regions［n（%）］

2.4 广西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 多态性与血脂水平相关性分析

rs16827546 C/T 位点携带CC 基因型LDL-C 和TC 与携带CT 基因型组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。rs10095483 A/C 位点AA 基因型的各项血脂指标水平与AC 基因型相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表4 miR-30 基因rs16827546 C/T 基因型的各项血脂指标比较［（±s）］Table 4 Comparison of blood lipid indexes of miR-30 rs16827546 C/T genotype［（±s）］

表4 miR-30 基因rs16827546 C/T 基因型的各项血脂指标比较［（±s）］Table 4 Comparison of blood lipid indexes of miR-30 rs16827546 C/T genotype［（±s）］

表5 miR-30 基因rs10095483 A/C 基因型的各项血脂指标比较（mmol/L）Table 5 Comparison of blood lipid indexes of miR-30 rs10095483 A/C genotype（mmol/L）

3 讨论

miRNA在生物体内存在初级miRNA（pri-miRNA）、前miRNA（pre-miRNA）及成熟miRNA三种形式，pri-miRNA、pre-miRNA经过Dicer 剪切和加工，成为成熟的miRNA，成熟的miRNA调控约60%的人类蛋白质的编码基因［5］。miR-30基因属于miRNA基因家族中重要的成员之一，其编码基因位于人类1、6 和8 号染色体上。研究发现［6］，大量靶基因翻译受到miR-30的调控，miR-30基因通过调节细胞凋亡、氧化应激、炎症和自噬等病理、生理过程，从而在细胞生长、组织分化和临床相关疾病的发病机制中发挥重要的调节作用。动脉粥样硬化是冠心病、缺血性脑卒中、外周血管病的主要发病原因，血脂代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，这是由于动脉壁巨噬细胞中胆固醇的积累和脂类代谢率的失调引起的，这种失调包括LDL-C、TG 和TC 水平的升高以及血清中HDL-C 的降低［7］。遗传因素被认为约占血脂代谢障碍发生率的50～80%［8］，Zhang 等［9］研究表明，上调miR-30对动脉粥样硬化具有保护作用。LDL-C 和TC 作为心血管疾病的生物标志物，研究发现，上调miR-30会降低血浆LDL-C和TC 水平［10］。此外，miR-30还可通过基因生物靶向作用减少脂质合成和含LDL 脂蛋白的产生，以避免脂肪变性和降低血浆脂质［11］。这些研究结果表明，miR-30可能是参与血脂调控的关键基因之一，其可能成为血脂异常类疾病治疗的潜在新靶点。

近年来，基因多态性与疾病的关系受到研究者的重视和广泛关注，成为基因研究领域的热点［12］。单核苷酸多态性（SNPs）是人类可遗传变异中最常见类型，是由于单个苷酸变异而引起DNA序列的改变，研究表明，miR-30基因有多个功能性SNPs 位点，这些功能性SNPs 位点与miR-30基因调控的相关疾病的发生和发展密切相关［13］，随着人类基因组计划的完成，多地区、多民族的分散研究成为基因多态性研究的前沿趋势［14］，Wang 等［15］对中国毛南族和汉族人群单核苷酸多态性与血脂的关系进行了研究，结果显示，G 等位基因携带者毛南人的高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平低于汉族人，其高胆固醇血症、高三酰甘油血症的患病率显著高于汉族人群；Ling 等［16］对我国京族和汉族基因多态性与总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的相关性进行了研究，结果分析显示不同基因型间血清TC 和LDL-C 水平存在显著性差异，因此说明不同民族和种族人群脂代谢相关基因的某些遗传特征和基因型可能有所不同。广西位于中国西南地区，属于中国少数民族的聚居地，本研究通过对289 例广西人群rs16827546 C/T和rs10095483 A/C 基因型和等位基因频率进行分析，结果显示，广西人群两位点的基因型和等位基因频率与人类基因组计划公布的CEU、YRI、TSI 相比较，其差异有统计学意义，而与我国北京汉族人群相比，差异无统计学意义。此结果说明，种族背景和地域差异是影响基因多态性的重要因素。在此次广西人群基因多态性与血脂的相关性研究中，本研究在分析广西人群位点rs16827546 C/T 和rs10095483A/C 不同基因型与血脂水平的差异后发现，rs16827546 C/T 位点两种基因型血脂之间比较，携带CT 基因型的TC（胆固醇）和LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）与CC 组比较，其差异有统计学意义。这说明广西人群miR-30多态性rs16827546与血脂的关系更为密切，今后在研究血脂相关疾病时，可优先考虑rs16827546 位点。

本研究是首次对广西地区人群miR-30基因簇rs16827546 和rs10095483 位点遗传多态性展开研究，揭示了广西人群miR-30基因上述两位点遗传多态性的分布特征，探讨分析了其基因多态性分布差异的可能原因，加深了对基因多态性的认识，为miR-30基因相关疾病的研究奠定了遗传学基础。本研究还发现广西人群rs16827546 C/T 多态性与血脂水平密切相关，这将为研究更多其他人群多态性数据及对以血脂异常为发病基础的相关疾病提供方向。然而，本研究的样本量较少，可能存在选择偏倚，在今后的研究中本课题组将加大样本量并且纳入人类遗传学中的环境、年龄、民族等因素进行多中心的前瞻性研究。