甲氨蝶呤的合成工艺改进

朱海溪，李靖*，刘美朝，陈彬，田帅华

1江苏奥赛康药业有限公司，南京 211112;2南京医科大学 药学院，南京211166

甲氨蝶呤（methotrexate，1）作为一种抗叶酸类药物，在肿瘤、类风湿性关节炎等疾病中有良好的疗效[1]。目前，文献报道用于生产甲氨蝶呤的方法主要以N-[4-（甲氨基）苯甲酰基]-L-谷氨酸-1，5-二乙酯（4）和6-溴甲基-2，4-蝶啶二胺氢溴酸盐（5）为起始原料，经取代反应得到（2S）-2-[[4-[[（2，4-二氨基蝶呤-6-基）甲基]甲氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸二乙酯（6），再经水解得到[2]，合成路线见图1。

图1 甲氨蝶呤的合成路线

该路线操作简单、收率较高，但存在两个问题：一是5活性高（易降解）、纯度偏低（含有机杂质约8%～9%）；二是在合成6的过程中，碳酸钾与氢溴酸反应生成水，蝶啶环顶端的氨基发生水解，易产生杂质C前体，并衍生为成品中的杂质C（图2）[3]，难以去除（按图1 所示方法，得到6的纯度为88.58%，其中杂质C前体含量为3.58%；继续合成甲氨蝶呤，其纯度为98.84%，其中杂质C含量为0.78%）。目前，杂质C在甲氨蝶呤原料药美国药典USP40 及欧洲药典EP10.0 中的限度为≤0.5%[4，5]，因此需要严格控制中间体和成品的质量。

图2 杂质C 和杂质C 前体结构式

经检索[6，7]，目前尚无6的纯化方法报道。本文在图1 的基础上，优化了合成路线，并开发了6的精制方法（图3）。即以4-甲氨基苯甲酸（2）、L-谷氨酸-1，5-二乙酯盐酸盐（3）为原料，经缩合反应得到N-[4-（甲氨基）苯甲酰基]-L-谷氨酸-1，5-二乙酯（4）[8]，4与6-氯甲基-2，4-蝶啶二胺盐酸盐（5′）在溴化钠作用下反应得到（2S）-2-[[4-[[（2，4-二氨基蝶呤-6-基）甲基]甲氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸二乙酯（6）[2]，6溶于N，N-二甲基乙酰胺中，搅拌下滴加对甲苯磺酸水溶液进行析晶，得到其对甲苯磺酸盐（6′），6′在氢氧化钠水溶液中脱去乙基得到甲氨蝶呤二钠（7），通过调节pH 可析出甲氨蝶呤（1）。新的合成路线能够降低6及6′中杂质C前体的含量，进而降低甲氨蝶呤中杂质C的含量。

图3 甲氨蝶呤新合成路线

2 合成实验

2.1 仪器与试剂

JY10002 电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；DF-101s 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；RAT-50D 玻璃反应釜（上海申顺生物科技有限公司）；LB-450 离心机（江苏赛德力制药机械制造有限公司）；FZG-15 方形真空干燥机（常州成博制药机械厂）。

4-甲氨基苯甲酸（2，南京况哲医药科技有限公司），L-谷氨酸-1，5-二乙酯盐酸盐（3，山东铂源药业有限公司），6-溴甲基-2，4-蝶啶二胺氢溴酸盐（5，上海赢瑞生物医药科技有限公司），6-氯甲基-2，4-蝶啶二胺盐酸盐（5′，广安百泉医药科技有限公司），其他试剂、溶剂均为市售分析纯。

2.2 化合物4 合成与确证

向50 L 玻璃反应釜中依次加入乙腈（8.32 kg）、N，N-二甲基甲酰胺（0.29 kg）、2（1.5 kg，9.92 mol），搅拌下降温至（5±5）℃；加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪（1.74kg，9.92mol）和N-甲基吗啉（3.01kg，29.76 mol），（0±5）℃反应1 h 后加入3（2.38 kg，9.92 mol），室温反应4 h 后过滤，向滤液中滴加纯化水（52.5 L）析晶，过滤干燥后得白色固体4（2.68 kg，收率约80.2%），熔点（mp）88～89℃。HPLC 纯度为99.28%，ESI-MS：m/z 337.1758 [M+H]+，1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：8.228（d，J=7.5 Hz，1H），7.678（d，J=9.0 Hz，2H），6.530（d，J=8.5 Hz，2H），6.247-6.218（m，1H），4.403-4.359（m，1H），4.114-4.02（m，4H），2.715（d，J=5.0 Hz，3H），2.430-2.400（m，2H），2.096-2.054（m，1H），2.016-1.995（m，1H），1.195-1.151（m，6H）。

2.3 杂质C 前体合成与确证

向500 mL 三颈瓶中依次加入“2.2”中4（54.6 g，162.3 mmol）、N，N-二甲基乙酰胺（270 mL），升温搅拌溶解。待溶液澄清后，加入5[69.4 g，含量78.6%（约含12%～13%左右的甲酰胺溶剂、8%～9%的有机杂质），162.3mmol]，55～60℃反应2h。降温至（25±5）℃后，将反应液转移至2 L 三口瓶中，滴加1.35 L纯化水，搅拌析晶过夜。过滤干燥后得棕褐色固体66 g，即化合物6，收率约70.6%，HPLC 纯度为88.58%，杂质C前体含量3.58%（LC-MS 提取分子量512）。取出部分化合物3，经制备液相提取、纯化，得到杂质C前体1.1 g，mp 170～172℃，HPLC纯度为99.0%[色谱柱为ACE Excel 5 Super C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为3.4 g·L-1无水磷酸二氢钠溶液（用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 值至6.0）-乙腈（95∶5）；流动相B 为乙腈；流速为1.0 mL·min-1；柱温为25℃；检测波长为260 nm；出峰时间为15.823 min]。ESI-MS：m/z 512.15[M+H]+；1HNMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：11.4506（s，1H），8.4972（s，1H），8.3182（d，J=7.48Hz，1H），7.7258（d，J=8.88Hz，2H），6.8076（brs，1H），6.7964（d，J=9.00 Hz，2H），4.7948（s，2H），4.4131-4.3578（m，1H），4.1157-4.0116（m，4H），3.1981（s，3H），2.4274-2.3900（m，2H），2.1060-1.9413（m，2H），1.1936-1.1398（m，6H）。

2.4 杂质C 合成与确证

向50mL 反应瓶中加入“2.3”中杂质C前体（1g，1.95 mmol）、纯化水10 mL，搅拌下滴加10%左右的氢氧化钠（0.3 g，7.5 mmol）水溶液3 mL，滴毕后使内温在（15±5）℃反应1.5 h。过滤，向滤液中滴加39 mL丙酮，析出固体。过滤，滤饼用10 mL 纯化水溶解，5%硫酸调节pH 值至4.0～4.5，析出固体，过滤干燥后得到杂质C约0.67 g，收率约75.4%，mp 183℃～184℃，HPLC 纯度为98%[色谱柱为Waters Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为3.4 g·L-1无水磷酸二氢钠溶液（用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 值至6.0）-乙腈（95∶5）；流动相B 为3.4 g·L-1无水磷酸二氢钠溶液（用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 值至6.0）-乙腈（50∶50）；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为280 nm；出峰时间为6.980 min]。ESI-MS：m/z 454.1507[M-H]-，1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：12.283（s，1H），11.458（s，1H），8.493（s，1H），8.208（d，J=8.0 Hz，1H），7.729（d，J=8.5 Hz，2H），6.893（s，1H），6.791（d，J=9.0 Hz，2H），4.790（s，2H），4.374-4.329（m，1H），3.193（s，3H），2.325（t，J=7.5 Hz，2H），2.076-2.039（m，1H），1.941-1.894（m，1H）。

2.5 化合物6 合成与确证

向反应釜中依次加入N，N-二甲基乙酰胺（10.97 kg）、“2.2”中化合物4（2.6 kg，7.73mol），搅拌下升温，待内温升至45℃后加入溴化钠固体（1.08kg，10.55 mol）和5′（2.09 kg，7.03 mol），保温60℃反应19 h。降温至（20±5）℃后滴加纯化水（58.4 L），搅拌析晶1 h，离心干燥后得到棕褐色固体6（3.2 kg，收率约81.0%），mp 177～179℃。HPLC 纯度约93.30%，杂质C前体含量约2.41%。

2.6 化合物6 纯化条件的考察

以“2.5”中化合物6为粗品，改变良性溶剂（溶解化合物6）种类、一水合对甲苯磺酸的用量，考察杂质C前体的精制效果，结果见表1。

从表1 可以看出，使用N，N-二甲基乙酰胺/对甲苯磺酸水体系、N，N-二甲基甲酰胺/对甲苯磺酸水体系、乙醇/对甲苯磺酸水体系均可以对化合物6起到精制效果；增加一水合对甲苯磺酸的用量，可以提高杂质C前体的清除效果、提高收率，但增加到1.2 eq 后达到平台。相比于乙醇，N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺是更优的良性溶剂。考虑到ICH Q3C 指南中N，N-二甲基乙酰胺的毒性更小，故选择N，N-二甲基乙酰胺/对甲苯磺酸水体系、一水合对甲苯磺酸用量为6的1.2 eq 为精制条件。

表1 化合物6 纯化条件的考察

2.7 化合物6′合成与确证

按照“2.6”中优化后的条件，向500 mL 反应瓶中加入N，N-二甲基乙酰胺（100 mL）、“2.5”中化合物6（20 g，39.2 mmol），搅拌溶解。室温下滴加对甲苯磺酸水溶液[8.9 g（46.8 mmol）一水合对甲苯磺酸溶于300 mL 水中]。滴毕后搅拌析晶1 h，过滤干燥后得橙黄色固体6′（22.7 g，分子量：682.75，收率约85.0%），mp 185～186℃，HPLC 纯度96.62%，杂质C前体含量0.15%。ESI-MS：m/z 511.2387[M+H]+，1HNMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：12.896（s，1H），9.290（s，1H），9.078（s，1H），8.728（s，1H），8.620（brs，1H），8.343（d，J=7.5 Hz，1H），7.745（d，J=8.5 Hz，2H），7.546（brs，1H），7.497（d，J=8.0 Hz，2H），7.121（d，J=7.5 Hz，2H），6.828（d，J=9.0 Hz，2H），4.880（s，2H），4.396-4.374（m，1H），4.101-4.016（m，4H），3.257（s，3H），2.405（t，J=8.0 Hz，2H），2.289（s，3H），2.099-2.060（m，1H），1.997-1.979（m，1H），1.187-1.141（m，6H）。

2.8 甲氨蝶呤二钠（7）合成与确证

依次向250 mL 反应瓶中加入纯化水98 mL、“2.6”中化合物6′（20 g，29.3 mmol），搅拌下滴加氢氧化钠（4.7 g，117.5 mmol）水溶液43 mL。滴毕后控温（15±5）℃反应1.5 h，反应结束后过滤，滤液转至1 L反应瓶中，搅拌下滴加丙酮423 mL 析晶。过滤干燥后得到黄色固体7（11.1 g，收率76.0%），HPLC 纯度为99.77%，ESI-MS：m/z 455.1763 [M-2Na+3H]+，1HNMR（500 MHz，CD3OD）δ：8.557（s，1H），7.777（t，J=7.5 Hz，2H），6.855-6.826（m，2H），4.812（s，2H），4.404-4.379（m，1H），3.209（s，3H），2.356-2.289（m，1H），2.277-2.204（m，2H），2.128-2.100（m，1H）。其中，杂质C含量约为0.07%。

2.9 甲氨蝶呤（1）合成与确证

向250 mL 反应瓶中加入“2.7”中化合物7（10 g，20.1 mmol）、纯化水100 mL，搅拌溶清后用5%硫酸溶液调节pH 至4.0～4.5，过滤干燥后得到黄色固体1（8.2 g，收率 约90%），mp 194～195℃，纯 度99.79%，杂质C含量约为0.08%[色谱柱为Waters Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为3.4 g·L-1无水磷酸二氢钠溶液（用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 值至6.0）-乙腈（95∶5）；流动相B为3.4 g·L-1无水磷酸二氢钠溶液（用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 值至6.0）-乙腈（50∶50）；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为280 nm]。ESI-MS：m/z 455.1791[M+H]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.5852（s，1H），8.1994（d，J=7.68 Hz，1H），7.7403（d，J=8.92 Hz，3H），7.5112（brs，1H），6.8327（d，J=9.04 Hz，2H），4.7934（s，2H），4.3879-4.3323（m，1H），3.2160（s，3H），2.3337（t，J=7.44 Hz，2H），2.0902-2.0429（m，1H），1.9562-1.8978（m，1H）。13C-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：174.0266（4°），173.8874（4°），166.3616（4°），162.7369（4°），154.8895（4°），150.9637（4°），149.1915（3°），146.2206（4°），128.9456（3°），121.4562（4°），111.0785（3°），54.8804（2°），51.8315（3°），38.8905（1°），30.5046（2°），26.0930（2°）。

3 结论

与使用图1 所示方法得到的甲氨蝶呤（纯度98.84%，杂质C含量为0.78%）相比，使用优化后的合成路线和精制方法，6′中杂质C前体的含量由6中的2.41%（合成实验“2.5”）降低至0.15%（合成实验“2.7”），继续向后反应得到甲氨蝶呤，其纯度为99.79%，杂质C的含量为0.08%（合成实验“2.9”），符合USP40 及EP10.0 对原料药的要求。