Lin28B对三阴性乳腺癌侵袭转移的影响及机制*
2023-05-17曹渤海胡月明田莉王俊然杨瑞东
曹渤海,胡月明,田莉,王俊然,杨瑞东
(1.唐山中心医院 病理科,河北 唐山 063000;2.滦州市人民医院 病理科,河北 滦州 063799)
三阴性乳腺癌属于侵袭性较强的乳腺癌,此类患者远处转移率与癌变复发率高,是临床上治疗与研究的重点之一[1-2]。研究发现,Lin28B与肿瘤的恶性程度呈正相关,在多种恶性程度高的肿瘤组织中呈过表达状态[3],参与肿瘤的发生、发展。本研究通过检测乳腺癌组织及癌旁组织中Lin28B及Let-7家族的表达情况,旨在分析Lin28B对乳腺癌侵袭转移的影响及其潜在机制,为乳腺癌的治疗提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2019年1月—2021年1月收治的80例三阴性乳腺癌女性患者为研究对象,年龄30~65岁、中位年龄(49.21±13.09)岁,绝经前37例、绝经后43例,有家族史19例,浸润深度[4]Tis+T1 23例、T2 39例、T3+T4 18例,远处转移41例、有淋巴结转移38例。纳入标准:(1)经病理学确诊为三阴性乳腺癌[5];(2)行手术治疗(其中T3和T4期患者先使用新辅助化疗后再行手术治疗)、且术后经病理检查确认;(3)临床资料完整。排除标准:(1)合并其他恶性肿瘤;(2)术前接受放疗、化疗、免疫疗法或靶向治疗;(3)合并严重糖尿病、甲亢等内分泌疾病。患者自愿参加试验并签署知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1免疫组化(SP法)测定癌组织、癌旁组织Lin28B蛋白表达 取三阴性乳腺癌患者癌组织、癌旁组织石蜡标本,每份标本制成厚度为4 μm连续切片5张,应用SP免疫组化法检测Lin28B蛋白的表达;一抗为鼠抗人Lin28B单克隆抗体(浓度1∶50,购自杭州联科美讯生物医药技术有限公司),以PBS代替一抗作为阴性对照,操作步骤严格按照说明书,由两名经验丰富的病理医师参照双盲法于高倍显微镜下观察免疫组化染色结果。Lin28B阳性着色定位于细胞质及细胞膜,以黄色或棕褐色颗粒为阳性判定标准[6],每张石蜡组织切片随机选取8个视野,以着色颜色及着色细胞数目为依据进行打分:0分为不着色,1分为浅黄色或浅棕色,2分为深黄色或深棕色,3分为棕褐色;阳性细胞数为0记0分,阳性细胞占全视野细胞数1%~10%记1分,阳性细胞占11%~50%记2分,阳性细胞占51%~80%记3分,阳性细胞占81%~100%记4分;染色分与阳性细胞数分的乘积为总分,总分>3分判定为阳性,否则为阴性。
1.2.2实时荧光定量-PCR(RT-PCR)法测定癌组织、癌旁组织Let-7家族成员miRNA相对表达量 采用Trizol法提取癌组织、癌旁组织中总RNA,提取试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,操作步骤按照说明书要求进行,采用紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)对所提取的RNA纯度进行检测,合格(A260/A280比值为1.8~2.2)后置于-80 ℃保存待测。采用RT-PCR 试剂盒(日本Takara公司)对癌组织、癌旁组织中的Let-7家族成员进反转录和PCR反应,以GAPDH 为内参,PCR引物由上海生工公司设计并合成。取cDNA 4 μL进行PCR扩增,反应条件95 ℃ 2 min、(95 ℃ 30 s,55 ℃ 35s,72 ℃ 60 s)×30个循环,72 ℃ 5 min。将RT-PCR扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶上电泳及鉴定,应用图像分析软件分析目的条带光密度/内参条带光密度,即目的基因相对表达量。
1.3 统计学分析
2 结果
2.1 Lin28B蛋白表达
免疫组化染色结果显示,Lin28B阳性着色定位于细胞质及细胞膜,表现为黄色或棕褐色颗粒,见图1。乳腺癌组织中Lin28B阳性率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 Lin28B蛋白在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达[n(%)]Tab.1 Expression of Lin28B protein in breast cancer and paracancerous tissues[n(%)]
2.2 不同浸润深度及转移的乳腺癌组织中Lin28B蛋白表达
随着浸润深度的增加,乳腺癌组织中Lin28B阳性率依次增加,Tis+T1、T2及T3+T4的Lin28B阳性率分别为52.17%、74.36%、88.89%,3组间差异具有统计学意义(P<0.05);远处转移阳性患者乳腺癌组织中Lin28B蛋白阳性率高于阴性患者、淋巴结转移患者乳腺癌组织中Lin28B蛋白阳性率高于无淋巴结转移患者(P<0.05)。见表2。
表2 不同浸润深度及转移乳腺癌组织中Lin28B蛋白表达Tab.2 Expression of Lin28B protein in breast cancer tissues with different invasion depth and metastasis
2.3 Let-7家族成员miRNA表达
乳腺癌组织中Let-7家族各成员miRNA相对表达量均低于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.001)。见表3。
表3 Let-7家族成员miRNA在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达(n=80)Tab.3 Expression levels of miRNA of Let-7 family members in breast and paracancerous tissues(n=80)
2.4 不同浸润深度乳腺癌组织中Let-7家族成员miRNA表达
随着浸润深度的增加,乳腺癌组织中Let-7家族成员miRNA相对表达量依次降低,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。
表4 Let-7家族成员miRNA在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达Tab.4 Expression levels of Let-7 miRNA family members in breast cancer tissues with different invasion depths
注:A扩增曲线,B熔解曲线。图2 RT-PCR检测不同浸润深度乳腺癌组织中Let-7家族成员miRNA表达曲线 Fig.2 RT-PCR detected-expression curves of Let-7 miRNA family members in breast cancer tissues with different invasion depths
2.5 转移乳腺癌组织中Let-7家族成员miRNA表达
远处转移乳腺癌患者、淋巴结转移乳腺癌患者癌组织中Let-7家族成员miRNA相对表达量分别低于无远处转移、或无淋巴结转移患者,差异具有统计学意义(P<0.001)。见表5、表6。
表5 有远处转移和无远处转移乳腺癌组织中Let-7家族成员miRNA表达Tab.5 Expression levels of Let-7 miRNA family members in breast cancer tissues with/without distant metastasis
表6 有淋巴结转移和无淋巴结转移乳腺癌患者癌组织中Let-7家族成员miRNA表达Tab.6 Expression levels of Let-7 miRNA family members in breast cancer tissues with/without lymph node metastasis
3 讨论
乳腺癌、肺癌和结直肠癌是女性最常见的3种癌症,其中女性新发癌症中的30%为乳腺癌[7-8],是全球范围内发病率最高的女性恶性肿瘤[9]。目前对大部分实体肿瘤的主要治疗方法即是手术切除,但不能有效地降低术后肿瘤的复发率及转移率。Lin28最早被发现存在秀丽隐杆线虫中,其能控制线虫发育的时间和空间,如果一旦产生突变将打乱幼虫的发育时间[10]。研究发现,Lin28在早期胚胎发育、干细胞分化中具有重要作用,是一类伴随RNA调控代谢过程的RNA结合蛋白[11],有研究发现Lin28B 与肿瘤的恶性程度、耐药性和不良预后呈正相关,提示 Lin28B 在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用[12]。
陈少坚等[13]研究发现,在肝癌细胞中Lin28 mRNA和蛋白呈高表达状态,且高表达的Lin28B可抑制HepG2细胞对5-Fu作用的敏感性;李建华等[14]指出,miR-125b可通过靶向调控致癌基因Lin28B水平影响肝细胞癌的增殖和侵袭,表明Lin28B的表达与肝癌的发生有密切的联系。另外,在卵巢癌和食管癌中也发现Lin28B过表达,说明Lin28B在恶性肿瘤中普遍表达过高[15-16]。本研究发现乳腺癌组织中Lin28B阳性率高于癌旁组织,表明Lin28B表达升高可能与乳腺癌的发生有关。Alam等[17]研究发现,非小细胞肺癌中Lin28B的表达与干细胞标记物HMGA2的表达成正比,且Lin28B表达的降低可抑制肿瘤细胞的增殖、转移。本研究发现随着乳腺癌浸润深度的增加,Lin28B的阳性率也随之升高,且已发生远处转移或淋巴结转移患者的Lin28B的阳性率明显增高,表明乳腺癌的转移程度可能与Lin28B的高表达有关。上述研究与本文结论基本一致。
Let-7是长度约20~23个核苷酸的非编码RNA(miRNA),与Lin28B一样,最早被发现于秀丽隐杆线虫中,可调控未分化细胞向分化细胞转化[18-19]。Let-7家族的靶miRNA主要是癌基因,可诱导靶miRNA剪切或阻碍其翻译,因而Let-7具有“抑癌基因”的功能。Let-7包括12个成员,在基因组中分布于8个以上基因簇中,并通常在癌症中呈现出低表达特征[20]。为进一步分析由Lin28B所诱发的癌症机制,在本研究中对Let-7家族成员表达水平进行测定,发现三阴性乳腺癌组织中的Let-7家族成员的miRNA相对表达量均低于癌旁组织,且随着浸润、转移情况的恶化和Lin28B表达的升高,Let-7呈现出低表达特征,表明Let-7的低表达与乳腺癌的发生和转移相关,推测Lin28B所诱发的癌症机制如下:Lin28B在Let-7家族的生物起源与mRNA翻译的转录调节过程中扮演负性调控角色,Lin28B可通过募集末端尿苷,对Dicer酶加工pre-Let-7的过程起到抑制作用,进而引起pre-Let-7降解,还可使pre-Let-7的转录停留在细胞核中,导致Dicer酶无法对其进行加工,从而抑制Let-7的成熟,进而抑制靶基因的表达、促进肿瘤细胞增值,导致癌症的发生与转移,如在乳腺癌、宫颈癌中Lin28B表达量的升高会导致Let-7表达的抑制,形成负反馈调控,促进癌细胞迁移侵袭[21-22];此外,Lin28B 和Let-7与某些因子(如RAS、MYC)结合形成复杂的网络后可激活大量癌基因及肿瘤信号分子,导致癌症的发生或转移[23-26]。