中国棱皮树蛙属新纪录种——河江棱皮树蛙

蓝俊麟，艾仁达，刘小龙，3，黄俊恺，杨云，陈明，魏平凡，袁智勇，3

（1.西南林业大学云南省高校极小种群野生动物保育重点实验室，昆明，650224；2.云南文山国家级自然保护区，文山，663099；3.西南大学生命科学学院淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆，400715；4.广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，桂林，541004）

1838 年Tschudi 建立棱皮树蛙属（Theloderma），该属物种主要分布在斯里兰卡、印度东北部、中国南方和东南亚，目前该属共有26 个种，其中在中国记录的有白斑棱皮树蛙（Th.albopunctatum）、背崩棱皮树蛙（Th.baibungense）、双色棱皮树蛙（Th.bicolor）、北部湾棱皮树蛙（Th.corticale）、印支棱皮树蛙（Th.gordoni）、河口棱皮树蛙（Th.hekouense）、砖背棱皮树蛙（Th.lateriticum）、棘棱皮树蛙（Th.moloch）、缅甸棱皮树蛙（Th.pyaukkya）和红吸盘棱皮树蛙（Th.rhodo⁃discus）10个种，云南省有白斑棱皮树蛙、双色棱皮树蛙、印支棱皮树蛙、河口棱皮树蛙、棘棱皮树蛙、缅甸棱皮树蛙和红吸盘棱皮树蛙7个种［1−3］。

2022年3月和7月，在云南省文山壮族苗族自治州两栖动物多样性调查中，采集到2 号棱皮树蛙属物种标本，经外部形态特征对比及分子系统发育关系分析，鉴定其为河江棱皮树蛙（Th.khoii），为中国两栖动物分布新纪录种。本研究对该物种进行了相应形态特征测量，并对采集地的生境作了描述，为进一步探讨该物种的分布情况提供基础性研究资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2022年3月和7月，在云南省文山壮族苗族自治州西畴县文山国家级自然保护区小桥沟片区内（23°21′38.89″ N，104°45′57.28″ E，海拔1 524 m），先后采集到棱皮树蛙雄性（SWFU 21369）和雌性（SWU 0002984）标本各1 号。组织样品储存在95%乙醇中以用于后续的分子实验，标本固定后浸泡在75%乙醇中，保存于西南林业大学生物多样性保护学院。

1.2 形态学测量

依据Ninh等［4］和费梁等［5］的测量方法，使用精确度为0.1 mm 的游标卡尺测量采集到的标本形态指 标：体 长（snout-vent length，SVL）、头 长（head length，HL）、头宽（head width，HW）、前眼角距（dis⁃tance between anterior corners of eyes，DAE）、后眼角距（distance between posterior corners of eyes，DPE）、眼径（eye diameter，ED）、前眼至鼻孔间距（distance from anterior corner of the eye to the nostril，EN）、第三指盘宽（width of discs of fingers Ⅲ，FD3）、股长（fe⁃mur length，FEL）、前臂长（forelimb length，FLL）、第四趾长（fourth toe length，FTL）、脚长（foot length，FOL）、手长（hand length，HAL）、鼻间距（internarial dis⁃tance，IN）、眼间距（interorbital distance，IOD）、下颌角与前眼角之间的距离（distance between angle of jaw and anterior corner of the eye，MBE）、下颌骨后部至鼻孔间距（distance from the back of the mandible to the nostril，MN）、下颌角与后眼角之间的距离（dis⁃tance between angle of jaw and posterior corner of the eye，MPE）、鼻孔至鼻尖间距（distance from nostril to the tip of the snout，NS）、吻长（snout length，SNL）、胫长（tibia length，TBL）、胫宽（maximum tibia width，TBW）、第三指长（third finger length，TFL）、鼓膜径（tympanum diameter，TYD）、鼓膜前缘至后眼角间距（distance from anterior margin of tympanum to posterior corner of the eye，TYE）和上眼睑最大宽度（maximum width of upper eyelid，UEW）。同时基于Ninh等［4］对河江棱皮树蛙的形态描述与采集标本进行形态比较。

1.3 分子系统发育分析

使用Thermo Fisher Scientific 公司提供的DNA提取试剂盒（Pure Link）对SWFU 21369 与SWU 0002984 的组织提取DNA，然后在冰箱中−20 ℃保存备用。16S rRNA 基因的扩增引物参照Simon等［6］的16S-1（5′-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3′）和16S-2（5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′）。PCR 反应程序：95 ℃预热5 min；95 ℃变性40 s，53 ℃退火 40 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，产物最后送至北京擎科生物科技有限公司测序。根据Ninh等［4］对棱皮树蛙属的最新研究结果，从NCBI 数据库下 载棱皮树蛙属物种的16S rRNA 基因序列与本研究 测定的序列进行整合分析，外群选取Nyctixalus pic⁃tus［7］（表1）。

表1 样品分子分析信息Tab.1 Sample information used for the molecular analysis.

使用MEGA 7.0［8］对样本的序列进行比对，用Kimura双参数模型计算物种间的遗传距离。系统发育分析分别采用贝叶斯分析法（BI）和最大似然法（ML），以一个特定的替代模型分析既定的Th.khoii16S rRNA 基因序列，“最佳”序列演化模型使用jModelTest 2［9］中实施的Akaike信息准则（AIC）推断。通过使用16S数据恢复的最佳模型是GTR+G。使用RAxML 8.2.10 进行ML 搜索［10］，并用1 000 个重复的非参数自举重采样评估ML分析下的自举支持。最后采用MrBayes 3.2进行贝叶斯系统发育分析［11］。本研究设置GTR+G 模型为核苷酸替换模型，使用马尔科夫链蒙特卡洛（MCMC）链独立运算4 次，共执行 2 000 万代，每1 000 代抽样1 次，抛弃前25%。通过查看分散频率的平均标准差（<0.01）确定取样是否达到稳定，然后通过Tracer v1.5 软件检测有效样本量（ESS>200）来检查各运行参数值是否收敛。

2 结果

2.1 形态描述

采集到的标本为成年雄性(SWFU 21369)和成年雌性(SWU 0002984)，相较于雄性(体长38.3 mm)，雌性体型更大(体长42.4 mm)；头部长度小于头部宽度，吻棱圆，吻端钝尖且短，眼大(雄性眼径长4.6 mm，雌性眼径长5.4 mm)，瞳孔黑色呈圆形，虹膜黄绿色，有不规则的黑色网状，眼睑有小刺。该标本各个部位度量数据见表2。

表2 河江棱皮树蛙成体测量值Tab.2 Measurements of adult Theloderma khoii

成年雄性(SWFU 21369)鼓膜明显呈深绿色，直径小于眼睛直径，周围有小疣粒。有颞褶，有犁骨齿，舌后端游离有缺刻。身体侧面图案有清晰的深棕色斑点，腹侧连接黄绿色带，腹部具有不规则黑色、黄绿色图案，喉上有少量较小的蓝色斑点，股后部黑色，有黄绿色条纹和一些红棕色疣(图1A-C)。前肢和后肢背表面有深绿色条纹，手指和脚趾盘均为绿色；有婚垫，婚垫呈淡黄色；有蹼，指末端膨大成吸盘；有趾沟，关节下瘤大而明显，第四指外侧面有缘膜，第四指外边缘有明显锯齿，指序为Ⅰ<Ⅱ<Ⅳ<Ⅲ。趾上有吸盘，趾末端膨大成吸盘并有趾沟，关节下瘤大且圆，第五趾外侧面有缘膜，趾序为Ⅰ<Ⅱ<Ⅴ<Ⅲ<Ⅳ(图1D-G)。

图1 河江棱皮树蛙形态（云南省西畴县法斗乡，SWFU 21369，雄性；艾仁达 摄影）Fig.1 Morphology of Theloderma khoii （Fadou Town of Xichou County，Yunnan Province，SWFU 21369，male.Photoed by AI Renda）

2.2 系统发育分析

采集的棱皮树蛙属标本与Th.khoii模式产地（越南东北部地区）标本聚在一个支系内（图2）。通过计算的遗传距离分析结果显示，棱皮树蛙属标本与Th.khoii遗传距离为0，共享同一单倍型，表明所采棱皮树蛙属标本为Th.khoii。

图2 基于线粒体16S rRNA 基因序列构建的棱皮树蛙属部分物种贝叶斯系统发育树（云南省西畴县法斗乡）Fig.2 Bayesian phylogenetic tree for Theloderma constructed based on 16S rRNA gene sequences （Fadou Town of Xichou County，Yunnan Province）

2.3 生境描述

云南文山国家级自然保护区为亚热带常绿阔叶林生态系统，受北部湾和孟加拉湾暖湿气流的影响，处于东亚季风与南亚季风过渡转变地区，呈现东部湿润、西部干燥，迎风坡湿润、背风坡干燥等气候特点；保护区为中山山地，区内河流较多，地形复杂，多为短小的山间溪流，气温空间变化也十分复杂，呈现西高东低的特点［12］。此次采集地位于云南文山国家级自然保护区的小桥沟片区，海拔1 524 m，采集到的标本与模式标本采集点海拔（1 320～1 750 m）相吻合。采集地有一条溪流，植被茂密以喀斯特地貌的常绿阔叶林为主，常年湿度较大（图3）。

图3 河江棱皮树蛙栖息地环境（艾仁达 摄影）Fig.3 Habitat of Theloderma khoii（Photoed by AI Renda）

3 讨论

系统发育分析结果显示，采集自云南文山国家级自然保护区的标本与河江棱皮树蛙的模式标本聚为一个支系，且遗传距离接近0，应为同一物种，证实了该物种在中国的分布。采集自云南文山国家级自然保护区的标本与河江棱皮树蛙模式标本在形态描述上基本一致，但在形态测量值上也存在一定的差异。二者的形态测量值差异主要表现在体长，头长，头宽，下颌骨后部至鼻孔间距，下颌角与前眼角、后眼角之间的距离，吻长，这些表型变化是物种地理种群变异的结果。云南文山国家级自然保护区标本采集地与河江棱皮树蛙模式产地纬度相差0.3°，直线距离超过50 km，由于河江棱皮树蛙树栖的生物学特征和喀斯特地区复杂的孤岛生境［13］，使得不同群体之间存在地理隔离，从而导致形态性状存在差异。

中国南部的棱皮树蛙属物种多样性较高，仅次于越南，迄今为止，共有10个种被纪录，云南多达7个种［2］。但该属目前的物种丰富度可能仍然是被低估的，结合形态学和分子生物学的数据，将有助于更好地揭示中国南部其他缺乏研究的地区的棱皮树蛙属物种丰富度。本次发现为我国棱皮树蛙属增加了一个物种新纪录。河江棱皮树蛙在云南文山国家级自然保护区的首次发现，进一步丰富了云南文山国家级自然保护区的生物多样性，同时对于保护区的生态保护和生物进化研究也具有十分重要的意义。

致谢：感谢西南林业大学康泽沼、李先琦同学在标本采集以及分子鉴定方面给予的帮助。