华南虎染色体核型分析及带型模式建立研究

龚志海，朱利永，任小冬 ，饶伟强，雷胜桥，吴莉莉，刘力军，张燕，李秋明，陈斌，谢和平

（1.广东粤北华南虎省级自然保护区管理处，韶关，512023；2.广东省岭南院勘察设计有限公司，广州，510500；3.杭州艾迪康医学检验中心有限公司，杭州，310030）

华南虎（Panthera tigris amoyensis）是我国特有的虎亚种，野外已多年未发现踪迹。我国在20 世纪五六十年代，先后从野外捕获到18 头华南虎，但仅6 头（2，4♀）有繁殖记录。全国各地圈养的华南虎都是这6 头繁殖的后代［1］。目前国内圈养的华南虎种群是一个高度近亲的种群，遗传多样性大大降低，种群生育率和幼崽成活率均较低。染色体作为生物遗传物质，是染色质在细胞分裂中期的特殊形态，是生物细胞遗传学的主要研究对象。染色体显带反映了调节DNA 复制、修复、转录和遗传重组的基因组功能结构。核型分析可用于探讨物种亲缘关系与进化、远缘杂种的鉴定以及遗传病的机制［2］，是评估染色体畸变的一种常规有效方法［3−4］，与荧光原位杂交、单核苷酸多态性阵列和基因组测序等其他更敏感的技术相比，核型分析的分辨率较低［4−5］。

华南虎作为濒危物种，在核型分析方面研究较少。张锡然等［6−7］对华南虎染色体核型进行了分组，报道了染色体臂比值等数据，并对东北虎（P.t.altaica）和华南虎染色体进行了比较，但对华南虎染色体带型的研究并不深入。本研究针对华南虎染色体核型和带型做进一步研究，利用G 带技术分析华南虎染色体核型及带型，初步建立华南虎染色体G 带核型模式图，以期充实华南虎染色体研究的基础资料，为虎亚种分类提供遗传学证据，同时为进一步研究华南虎种群遗传基因提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

以华南虎繁育研究基地的饲养华南虎外周血为研究对象。将成年虎麻醉保定（舒泰0.02 mg/kg+多咪静0.02 mL/kg），幼虎人工保定，从后肢或尾部采集外周血液样本。将外周血样置于肝素钠抗凝真空采血管（山东康利莱医疗器材有限公司）内，轻轻颠倒混匀数次，使抗凝剂与血样充分接触、溶解，防止凝固。在2020—2022 年，共采集8 只虎（6，2♀）的血样。

外周血样在运输过程中避免剧烈晃动，在极 热或极寒条件下保温运输。血样在48 h 内接种，当日无法接种或已接种后的标本可置于冰箱4 ℃保存。

1.2 染色体标本制备与培养

各取0.4 mL肝素钠抗凝外周血平行接种于2瓶淋巴细胞培养液（广州白云山拜迪生物医药有限公司）中，混匀后置二氧化碳培养箱（THERMO ELECTRON HEPA CLASS 100）37 ℃培养72 h。加入40 μg/mL 秋水仙素20 μL，作用80 min 后收获淋巴细胞，收获步骤：（1）将培养细胞转移至15 mL 离心管中，1 500 r/min，离心10 min，去上清，加入0.075 mol/L KCl 低渗，37 ℃水浴，1 500 r/min，离心10 min，去上清，细胞预固定，即直接在低渗后的细胞悬液中缓慢加入2 mL新鲜配制的固定液［V（甲醇）∶V（冰醋酸）=3∶1］，轻轻混匀细胞，吹气法吹打4～9次后，1 500 r/min，离心10 min 后倾去上清。（2）细胞固定，即加入固定液8 mL，用吹气法轻轻吹打细胞数次，直至细胞完全分散，盖上盖子，室温下静置30 min，离心机1 500 r/min，室温下离心10 min，去上清。（3）再次细胞固定，重复（2）步骤。吸取固定好的细胞悬液均匀滴于冰玻片上（5 或6 滴），过火，80 ℃烤片1 h，胰酶G 带处理，Giemsa 染色。显微镜（OLYMPUS CX41）低倍镜下寻找良好分裂相，高倍油镜下观察形态清晰、分散良好和背景干净的染色体中期分裂相，并显微摄影。

1.3 核型分析方法

每例染色体标本至少选取20 个分散适宜、染色深浅适宜和显带清晰的中期分裂相计数，并至少分析5 个分裂相。若发现有嵌合可能，则增加计数至50 个分裂相。利用染色体核型分析系统（以色列ASI）拍片、存档。依据《ISCN》（人类细胞遗传学国际命名体制）对染色体核型进行分析诊断。

2 结果

2.1 染色体数

镜检80 个华南虎淋巴细胞的染色体中期分裂相，发现细胞染色体数少于38 条的比例为6.25%，染色体数为38 条的比例为93.75%，染色体数大于38条的比例为0。绝大多数（93.75%）淋巴细胞的染色体数为38 条，因此，华南虎外周血细胞染色体数为2n=38条（n=19）（图1）。

图1 华南虎染色体中期分裂相Fig.1 Metaphase division phase of chromosomes in south China tiger

2.2 染色体核型

选取20 个有丝分裂中期分裂相良好、边缘清晰的染色体，测量长臂、短臂和着丝粒，计算相对长度、臂比值及着丝粒指数，依照染色体大小递减排列，将常染色体依次编号为1～18，性染色体不编号，分别以X和Y排列在最后。

根据着丝粒位置分类方法［8］，华南虎18 个常染色体中，2、5、13、18 号染色体为中部着丝粒染色体（m）；1、4、7、8、9、10、11、12、14、17 号染色体为亚中部着丝粒染色体（Sm）；3、6 号染色体为亚端着丝粒染色体（St）；15、16 号染色体为端着丝粒染色体（t）。性染色体X 为1条较大的中部着丝粒染色体（m），性染色体Y 为所有染色体中最短的1 条亚中部着丝粒染色体（Sm）（表1）。核型公式为8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m）。雄、雌华南虎染色体镜检见图2。

表1 华南虎染色体特征Tab.1 Chromosome characteristics of south China tiger

图2 雄（A）、雌（B）华南虎染色体镜检结果Fig.2 Chromosomal microscopy of male（A）and female（B）south China tiger

2.3 染色体G带带型模式

从染色体G 带带型看，华南虎同源染色体带纹基本一致，带纹在每一对染色体上的数目和分布具有明显的特征。不同长度染色体具有不同的带纹，一般染色体长度越长带纹越多（图3）。常染色体中带纹最多的是1 号染色体，G 带数为24 条带；带纹最少的是18号染色体，G带数为6条带。X染色体长度介于9 号和10 号染色体之间，G 带数为12 条带。Y染色体是所有染色体中最短的染色体，G 带数仅为 3条带（图4）。

图3 华南虎染色体G带Fig.3 Chromosome G-banding of south China tiger

图4 华南虎染色体G带核型模式图谱Fig.4 G-banding karyotype pattern map of south China tiger

3 讨论

3.1 样本采集、细胞培养及染色体制备

染色体的相关研究一般采用肾组织培养的方法，该方法成功率较高、效果较好，但对于华南虎等凶猛且濒危的哺乳动物来说却存在较大风险，采样难度大。本研究选取华南虎的外周血液样本作为研究对象，虽降低了采样难度，但较难进行重复采样，因此，在细胞培养时规范操作，按规定的试验步骤提高试验成功率。

华南虎外周血淋巴细胞培养是染色体标本制备成功的关键步骤。将血样接种至淋巴细胞培养液后放进培养箱中培养，使淋巴细胞从G0 进入细胞周期，开始DNA 复制，当淋巴细胞处于分裂中期时，是进行核型分析和染色体研究的最佳时期。秋水仙碱能破坏并阻止形成细胞的纺锤体，使分裂的细胞停留在分裂中期，此外，秋水仙碱还可使染色体收缩，使染色体形成清晰的轮廓［9］。低渗处理可使细胞肿胀，有利于染色体的分散，空气干燥可使细胞和染色体展平。由于染色体标本制作过程较长，包括细胞培养、秋水仙素处理、低渗、固定、制片、消化和显带等步骤，中间还涉及反复混匀、离心，因此，培养基的成分、pH 值、固定效果、离心和混匀的力度等都是影响染色体标本制备成功的重要因素［10］。此外，试验材料、秋水仙素浓度、处理时间、低渗溶液种类和滴片时温差等均可对染色体的实际长度、相对长度及臂比值产生影响［11］。所以，还需要更多试验研究来丰富华南虎染色体核型带型方面的内容。细胞学的核型分析资料作为分类学的证据，结合形态学、解剖学、胚胎学和遗传学等方面的证据，在解决物种分类的疑难问题上发挥不少作用，而且是建立生物学物种和新的自然分类系统所必不可少的资料［12］。因此，华南虎染色体核型带型研究十分必要。

3.2 染色体核型分析

华南虎染色体组内各条染色体的长度不一致，绝对长度可通过显微镜测量，也可采用放大照片测量后换算得出。由于染色体制片过程中使用的药剂和方法不同，以及标本固定供观察时细胞分裂不可能保证在同一时期，故染色体的收缩会有所差异而导致染色体绝对长度在同一物种或个体的不同细胞间产生差异，针对这种情况，在分析中常以相对长度作为度量染色体长度的标准。相对长度排除了因技术原因引起的染色体收缩程度不同所产生的差异，因此，相对长度值是一个较稳定的可比较的数值。染色体以相对长度从长至短排序编号，将性染色体单独列出，进而能更好地与同类相关研究进行比较。染色体的臂比和着丝粒指数也是染色体的重要特征，反映着丝粒的相对位置。在核型测量过程中可能存在一定的测量误差，要对华南虎染色体进行精确研究，可利用染色体显带或荧光原位杂交等技术，提高同源染色体配对的准确性，从而更精确地分析华南虎的核型特征。

张锡然等［6−7］研究表明，华南虎染色体数为38条，其中包含1 对性染色体，与本研究结果一致，但因采用的计算和排序方法不同，使核型分组结果与本研究结果无法直接比较。从华南虎染色体分组来看，本研究结果与张锡然等［6−7］研究存在明显区别，其认为华南虎染色体应分为5 组，即A 组6 对（Sm），B 组6 对（m），C 组3 对（St），D 组2 对（t），E 组1 对（m），XY 性染色体皆为中着丝粒染色体，而本研究得到的华南虎染色体核型公式为8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m），造成这种差异的原因有待进一步研究。另外，张锡然等［6−7］研究中通过银染发现18 号染色体存在次缢痕，而本研究因仅进行G 带核型分析，所以未发现存在次缢痕的染色体，该情况也需要进一步研究才能得出结论。

与郑维平等［13］研究的东北虎染色体核型特征数据进行比对，发现华南虎与东北虎虽然都是38 条染色体，但多条染色体存在差异，如华南虎4 号、7 号、11 号和Y 染色体臂比值分别为（2.521±0.262）、（2.525±0.263）、（2.357±0.245）和（2.982±0.308），而东北虎4 号、7 号、11 号和Y 染色体臂比值分别为（1.063±0.092）、（1.545±0.071）、（1.500±0.063）和（1.000±0.022），对比以上数据可知，华南虎与东北虎在染色体形态上具备足够的差异，在动物分类学上可将染色体核型作为虎亚种判定的一种依据。

3.3 G带带型分析

华南虎染色体每个分裂相中同源染色体带纹基本相同，按照带纹的特征能将同源染色体准确配对，G 带的研究结果显示雄性华南虎的核型公式为2n=38=8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm），雌性华南虎的核型公式为2n=38=8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XX（m，m）。在G 带分析前仅按照染色体相对长度和臂比值进行分组排序存在误差的可能性较大，如本研究中华南虎7 号和8 号染色体的相对长度和臂比值非常接近，在类似常规染色体核型中难以区别。因此，使用吉姆萨干性混合物作为染色试剂，可在染色体上产生某种特定的带型模式，这种G 带技术方法有利于染色体的分组和排列。因此，在考察G 带数时，通常不能简单地分析分带的数目，而应分析分带的分布趋势以及稳定性，特别是以某些深色区带或非着色区位置作为鉴定的依据［14］。研究发现华南虎G 带带型特征及数目与显带处理条件有密切关系，对开展猫科（Felidae）动物细胞遗传学特性、染色体基因定位及染色体多态性改变的研究有重要意义。染色体的带分布于臂的不同区，在识别染色体时，这些连续和明显的形态学特征具有重要意义。

目前，国内关于华南虎染色体研究的文献资料极少，因此，本研究中华南虎染色体核型模式图谱仅为初步研究结果，华南虎的核型及部分带型与张锡然等［7］的相关研究存在差异还有待进一步深入研究。

4 结论

通过G 带技术对华南虎染色体进行核型及带型分析，初步建立华南虎染色体G 带核型模式图，得出结论：（1）华南虎的二倍体染色体数为2n=38 条，其中常染色体18 对，性染色体1 对。（2）核型公式为8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m）。（3）经比对发现，华南虎与东北虎染色体核型存在明显差异。研究结果能为华南虎的细胞遗传学研究提供更为详实的基础资料，促进华南虎物种保护事业的发展。