宫颈细胞p16/MCM2双项联检免疫细胞化学染色流程的探讨与体会

李菲,段赞,王涛,卓静,杜丽,詹世宁（江苏省徐州市肿瘤医院,江苏 徐州 221000）

目前，在全球女性生殖系统恶性肿瘤中宫颈癌的发病率仍高居榜首，在我国，宫颈癌发病率依然呈上升趋势。随着人乳头状瘤病毒（HPV）疫苗的接种、宫颈癌筛查的普及以及医疗水平的发展，我国宫颈癌患者的5年生存率较之前有明显的提升，但是不同地区之间依然存在较大的差异[1]。HPV检测及子宫颈细胞学检查是目前宫颈癌筛查的主要方法，然而这两种方法联合起来对患者进行分流依然存在漏诊，尤其是子宫颈高级别病变[2-3]。免疫细胞化学技术（immunocytochemistry，ICC）在日常工作中已经成为形态学诊断中一种重要的辅助方法[4]。p16基因又称MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，属于抑癌基因，在调节细胞周期G1-S期中起着关键作用，在HPV相关的宫颈上皮内病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）中，HPV的E7蛋白抑制Rb基因的活性，导致p16合成异常增加，高表达于细胞核及细胞浆中[5-6]。微小染色体维持蛋白2（Minichromosome maintenance protein 2，MCM2）是DNA复制中的启动子，参与细胞周期的调控，表达于高增殖活性的细胞核内，表达过度被认为是细胞周期失调的标志[7-8]。有研究显示，p16和MCM2高表达于宫颈上皮内病变中，且病变程度越高其阳性率越高，故此，p16和MCM2在宫颈上皮内病变的筛查及鉴别诊断中具有较高的应用价值[9]。笔者采用免疫细胞化学技术对宫颈细胞学标本进行p16/MCM2双项联检染色，经过反复的探索与实践，优化了相关染色流程，取得了较好的效果，现就染色流程、染色结果判读及相关经验体会总结如下。

1 材料与方法

1.1材料 收集徐州市肿瘤医院2022年7月-2022年11月宫颈液基细胞学标本150例，年龄20-68岁，平均年龄44.5岁。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器 宫颈脱落细胞保存液及p16/MCM2双项联检ICC试剂盒均购置于重庆沃康科技有限公司，全自动免疫组化染色机（CWC-30）购置于宁波察微生物科技有限公司，所采用的试剂与仪器均通过重庆沃康科技有限公司的验证。

1.2.2制片及染色主要流程 ①纯化：于10ml离心管中加入4ml液基细胞分层液，套上过滤筒，再加入6ml细胞离散静置后的中下层细胞悬液标本，2000r/min，水平转离心10min，去上清液，加细胞缓冲液至1-3ml，在漩涡振荡器上震荡1min，使细胞混匀打散，制成细胞悬液。②制片：在制片单元中加入细胞预处理后的细胞悬液1ml，室温静置10min，倒去残液，取出玻片室温晾干。③固定：将细胞制片放入无水乙醇中，室温孵育30min，室温充分晾干。④修复：使用高压修复方法，将细胞制片放入装有柠檬酸钠抗原修复液（pH6.0）的染色缸中，将染色缸放置于加有1/3水位的高压锅中，待加压阀放气时开始计时，修复时间15min，然后自然冷却至室温。⑤灭活和封闭：滴加内源性过氧化物酶阻断剂100ul/片，室温湿盒孵育10min，PBST清洗3次，每次1min，适度甩干（不可干片），滴加封闭剂，室温下湿盒孵育10min。⑥一抗孵育：将试剂盒中的抗体稀释液和p16一抗浓缩液混合后，加入到MCM2一抗浓缩液中，配置成p16/MCM2一抗工作混合液，滴加于细胞制片上，室温湿盒孵育60min，PBST清洗3次（每次3min）。⑦二抗孵育：将试剂盒中的羊抗鼠二抗工作液加入到羊抗兔二抗工作液中，配置成羊抗鼠/兔二抗工作混合液，滴加于细胞制片上，室温湿盒孵育30min，PBST清洗3次（每次3min）。⑧DAB染色：根据标本量，取适量的DAB染色底物和DAB染色剂缓冲液混匀制备成DAB工作液，滴加DAB工作液45-50ul/片，室温湿盒孵育5-10min，蒸馏水冲洗3min。⑨red染色：根据标本量，按AP-red色原液：AP-red显色缓冲液=1∶75进行AP-red工作混合液的配制。一抗和二抗孵育之后，细胞制片滴加AP-red工作混合液47ul/片，室温湿盒孵育20min，蒸馏水冲洗3min。⑩复染：将细胞制片放入苏木素染料中进行复染，流水冲洗3min，吹干。

封片：滴加中性树胶、加盖玻片，干片后，光学显微镜下观察。

2 结果

在高级别鳞状上皮内病变（high-grades quamous intraepithelial lesion，HSIL）（见图1A）及非典型鳞状细胞，不除外高级别鳞状上皮内病变（atypical squamous cells，cannot exclude HSIL，ACS-H）（见图1B）中异常细胞的细胞核显红色或者红棕色，细胞浆显棕色。在低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）（见图1C）及非典型鳞状上皮细胞中意义不明确（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）（见图1D）中，单个异常细胞核呈红色且细胞核形态、大小异常。无上皮内病变或恶性病变（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）（见图1E-F）的细胞核显蓝色/红色（但细胞核形态正常）、细胞浆只有苏木素衬染的淡蓝色或者细胞核蓝色/棕色、细胞浆棕色。

图1 A：在HSIL中p16（+）/MCM2（+），异常细胞（细胞核显红色或者红棕色，细胞浆显棕色）≤5个。B：在ASC-H中p16（+）/MCM2（+），异常细胞（细胞核显红色或者红棕色，细胞浆显棕色）≥5个。C：在LSIL中p16（-）/MCM2（+），异常细胞（核呈红色且细胞核形态、大小异常）≥3个。D：在ASC-US中p16（-）/MCM2（+），异常细胞（核呈红色且细胞核形态、大小异常）≤3个。E-F：在NILM中p16（-）/MCM2（+），或p16（+）/MCM2（-），正常细胞（细胞核显蓝色/红色，细胞核形态正常，细胞浆只有苏木素衬染的淡蓝色或者细胞核蓝色/棕色、细胞浆棕色）

3 经验体会

①不是所有的宫颈细胞保存液都适用免疫细胞化学技术，曾尝试使用多家公司生产的细胞保存液，有些保存液制作出的片子效果欠佳，尤其是细胞量及染色效果方面并不理想。推荐沃康、HOLOGIC和泰普等细胞保存液。使用非推荐品牌的宫颈细胞保存液进行检测时，存在非特异结合较强、特异性染色较弱的问题。②本科室曾将放置超过一周的阳性对照片玻片进行p16/MCM2双项联检ICC染色，结果显示阳性细胞数量远远低于在2℃-8℃冰箱保存且不超过一周的标本制作的阳性对照玻片。所以制作好的玻片标本不可长时间在空气中保存，应存放于2℃-8℃冰箱中不超过一周时间，放置时间过久，细胞内的抗原成分会丢失。③黏液过多的标本易引起非特异性染色，故需在标本中添加适量的黏液液化剂。④推荐采用间接高温高压抗原修复法，此种方法抗原修复液消耗量较少，抗原修复效果较好，尤其是细胞核抗原。⑤建议采用专用的柠檬酸钠抗原修复液（pH6.0）。⑥苏木素复染后，由于red染料原因，不可进行分化、通透和脱水。⑦不同季节如果室温不同，要适当调整red染色时间。⑧由于标本中含有黏液等成分，为避免标本溢出，往离心管中加入标本液时要倾斜离心管，沿管壁缓慢加入。⑨抗体浓度过高或者过低会引起非特异性染色或者定位不准确，从而影响染色结果。⑩滴加试剂要均匀且足够，以免边缘细胞不着色。11PBS冲洗要彻底，染色全程不可出现干片现象，以防止背景着色。12血性标本会引起非特异性染色及覆盖鳞状上皮细胞，对于血性标本可以离心处理吸取中间层细胞制片。

4 讨论

根据2022年2月国家癌症中心发布的最新的全国癌症统计数据，在我国，宫颈癌发病率和死亡率仍呈上升的趋势。人乳头状瘤病毒（HPV）感染是引起宫颈癌的主要病因，高危型HPV持续性感染可引起宫颈上皮内病变和宫颈癌，一些外阴及阴道上皮内病变亦和HPV感染有关[10]。HPV检测在临床工作中现已被广泛应用，但一些被感染的患者在自身免疫系统作用下会自行消除病毒，仅少部分高危型HPV持续感染会进展为宫颈癌，与病理组织学检查结果存在一定的差异[11-12]。宫颈细胞学检查是宫颈上皮内病变筛查的主要方法之一，但由于操作流程的差异，染色结果也不尽相同，致使宫颈细胞病理学诊断的一致性较差，存在漏诊和误诊，尤其对于高级别鳞状上皮内病变的漏诊率较高，利用p16蛋白的检测在一定程度上可以弥补TCT只观察细胞形态的不足之处[13]。HPV的E7蛋白通过取代E2F转录因子而与Rb结合导致MCM2异常转录的启动和S期诱导异常，使得MCM2在宫颈癌和宫颈上皮内病变中高表达。有研究显示，HPV灵敏度高但特异度低，TCT特异度高但是灵敏度低[14]。郑健[15]等人研究显示MCM2免疫细胞化学检测结果的灵感度和特异度均比HPV检测结果高，普遍表达于宫颈上皮内病变中，且宫颈上皮内病变越重其阳性表达率越高，在宫颈癌及宫颈癌前病变中有较好的筛查作用。免疫细胞化学技术应用于宫颈细胞学双染中具有简单高效、结果准确、可重复等优点，能够提高诊断率、减少漏诊率，在一定程度上降低或避免了过度的阴道镜检查，可作为临床宫颈癌筛查的一种方法[16-17]。研究显示p16、MCM2在宫颈上皮内病变中同时存在异常表达[18]，另有研究显示p16、MCM2同时高表达与高危型HPV的致癌活性直接相关，且联合检测p16、MCM2在宫颈上皮内病变的诊断中灵敏度高于宫颈细胞学的检查，特异度高于HPV检测[19]。

综上所述，p16/MCM2双项联检免疫细胞化学技术从蛋白水平来标记异常宫颈鳞状上皮细胞，如果标本中仅有几个异常的鳞状上皮也能被标记出来，从而有效避免了漏诊，并且对宫颈癌及癌前病变进行风险评估、对癌筛人群的分流提供了有效的帮助。良好的染色流程与方法对于结果的准确性至关重要。通过近期对染色流程的反复摸索与实践，大大提高了p16/MCM2双项联检免疫细胞化学技术的稳定性，为临床医师对患者病情的分析提供了极大的指导作用。