基于网络药理学和分子对接研究喘可治注射液治疗支气管哮喘的机制

周域，邓丽平，胡俊，吴勐，寿玥莺，高洁婷，李韦

平湖市第一人民医院药剂科，浙江平湖 314200

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病[1]，以发病率高、危害大、反复发作为特点，对人体生命健康造成严重危害。目前，全球支气管哮喘患者已超过3.58 亿，其中我国约占6.67%[2]。临床常采用β2受体激动剂、M 胆碱受体阻断剂、吸入性糖皮质激素、白三烯受体阻断剂、磷酸二酯酶抑制剂等药物治疗，但不良反应较多、易耐受等问题突出。中医治疗支气管哮喘能够改善患者症状且不良反应少，不易产生耐药性，具有一定的治疗优势。中医认为肾主纳气，若肾气不足，则出现呼多吸少、吸气困难、动则喘甚等症。喘可治注射液为国家二类新药，主要由淫羊藿、巴戟天组成，其味甘性温，入脾肾经，功能温肾助阳，止咳平喘[3]。本文采用网络药理学与分子对接验证对喘可治注射液治疗支气管哮喘的活性成分、靶点、通路、生物过程等进行研究，为临床合理用药提供佐证。

1 资料与方法

1.1 确定活性成分

运用中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中药综合数据库（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）中以“淫羊藿”“巴戟天”为关键词检索喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天2 味中药的活性成分，以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18 为标准进行筛选，并结合相关文献纳入活性成分。从ChemicalBook、PubChem 中获得活性成分相关化学信息及化学结构，保存为sdf 格式文件。

1.2 活性成分-靶点筛选

将从PubChem 数据库中获取的活性成分的分子结构上传至SwissTargetPrediction 数据库。以“淫羊藿”“巴戟天”为关键词在TCMSP 数据库中检索喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天2 味中药的活性成分所对应靶蛋白，在人类基因数据库（the human gene database，GeneCards）中将所得靶蛋白转换为对应靶点，整合并删除以上2 个数据库中重复靶点后明确活性成分中的最终靶点。

1.3 疾病靶点筛选及活性成分-支气管哮喘靶点构建

以“支气管哮喘（bronchial asthma）”为关键词，在GeneCards、比较毒理基因组学数据库（comparative toxicogenomics database，CTD）中进行检索。整合去重后得到支气管哮喘靶点。将支气管哮喘靶点与活性成分靶点输入Fun Rich 软件，二者交集作为喘可治注射液治疗支气管哮喘的靶点，将上述靶点导入Cytoscape软件构建活性成分-支气管哮喘靶点图。

1.4 活性成分-靶点相互作用网络构建

将活性成分-靶点导入STRING 平台构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值“medium confidence=0.4”，其他参数保持默认值。将PPI 网络导入Cytoscape 软件，利用“network analysis”功能计算各网络节点的度值、介数及最短路径等拓扑参数，节点的度值、介数、最短路径越大，该节点在网络中的位置就越重要[4]。选取度值、介数、最短路径同时在平均值之上的靶蛋白、活性成分作为喘可治注射液治疗支气管哮喘的关键靶点和关键活性成分。

1.5 KEGG 通路富集和GO 生物过程分析

运用DAVID 数据库以P＜0.05 为标准，对喘可治注射液治疗支气管哮喘的靶点进行KEGG 信号通路富集，在OmicShare 云平台进行可视化处理。利用Origin 软件将得到的GO 生物过程进行可视化处理并以图片形式输出。

1.6 活性成分与支气管哮喘关键靶点的分子对接验证

从PDB 蛋白质结构数据库下载关键靶点的蛋白质结构。借助PyMOL 将靶蛋白与原配体分离，同时去除靶蛋白的水分子、磷酸根及多余的非活性配体，进行分子对接前的处理。将靶蛋白导入AutoDuck Tools进行加氢、电荷等操作。将关键活性成分的2D 结构导入Chembio3D 后，以mol2 的格式保存，将靶蛋白、原配体、关键活性成分3D 结构统一设置成AutoDuck Tools 可识别的pdbqt 格式。设置原配体所在部位为活性口袋位点，进行关键靶蛋白和关键活性成分的分子对接，以评价活性成分与靶点的结合强度。

2 结果

2.1 活性成分筛选

通过检索TCMSP、TCMID 数据库，结合文献筛得喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天的活性成分，其中7 个活性成分来自淫羊藿，2 个活性成分来自巴戟天，见表1。

表1 喘可治注射液的主要活性成分信息

2.2 喘可治注射液靶点预测及其靶点-活性成分网络图构建

检索TCMSP、SwissTargetPrediction、GeneCards数据库中巴戟天、淫羊藿的活性成分相关靶点，整合去重后得到活性成分靶点 112 个。检索整合GeneCards、CTD 数据库中支气管哮喘相关靶点，得到2369 个疾病靶点。将活性成分靶点和支气管哮喘靶点导入Fun Rich 软件，去重后得到66 个治疗支气管哮喘靶点，见图1。将活性成分及其靶点导入Cytoscape 软件，得到靶点-活性成分网络图，见图2。

图1 活性成分-疾病靶点韦恩图

图2 活性成分-疾病网络图

2.3 靶点PPI 网络分析

将66 个活性成分-疾病靶点导入STRING 平台，在Cytoscape 软件中进行可视化处理，PPI 网络中共有66 个节点，420 条相互作用连线，平均度值为12，平均介数为0.016，见图3。度值和介数均大于平均值的靶点有18 个，见表2；度值、介数均大于平均值的活性成分有5 个，见表3。由此预测喘可治注射液中关键活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定B、淫羊藿A、低聚七糖、蔗果四糖，主要通过调节肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、β2 肾上腺素受体（beta2 adrenergic receptor，ADRB2)、5-羟色胺转运体基因（SLC6A4）等18 个关键靶点达到治疗支气管哮喘的功效。

表2 关键靶点及其拓扑参数

表3 活性成分拓扑参数

图3 靶点PPI 网络

2.4 KEGG 信号通路分析

将喘可治注射液66 个支气管哮喘靶点富集在KEGG 信号通路上，根据P＜0.05 筛选得到支气管哮喘相关信号通路13 条，见表4。富集因子较大的通路包括丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）/cGMP 依赖性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）信号通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路等。

表4 KEGG 信号通路

2.5 GO 功能富集分析

以P＜0.05 为原则在DAVID 数据库对66 个支气管哮喘靶点进行GO 功能富集分析，得到12 条生物过程，见表5。预测喘可治注射液可能通过参与这些生物过程治疗支气管哮喘。

表5 GO 功能富集分析

2.6 分子对接

分别选取淫羊藿、巴戟天中度值、介数排名第一的有效成分淫羊藿次苷I 和蔗果四糖，与排名前5位的支气管哮喘相关靶点进行分子对接验证。结果显示淫羊藿次苷I 与TNF、前列腺素内过氧化物酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）结合程度高，蔗果四糖与信号转导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、α2A 肾上腺素能受体（alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）结合程度高，见图4。

图4 关键活性成分与作用靶点分子对接结果

3 讨论

支气管哮喘属中医哮证、喘证、痰饮等范畴，中医认为支气管哮喘的发生与宿痰内伏于肺有关[5]。支气管哮喘对身体健康和日常生活具有一定危害，急性发作时需采取积极治疗措施以控制临床症状。中成药喘可治注射液的主要成分为淫羊藿、巴戟天，能够有效发挥止咳平喘、补益肾肺、化痰健脾、固本培元之功效[6]。淫羊藿始载于《神农本草经》，为小檗科植物淫羊藿的干燥地上部分[5,7]。实验证明淫羊藿可使哮喘大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素mRNA 表达明显上调[8]。巴戟天是我国著名的四大南药之一，具有抗应激、抗炎的功效[9]。

本研究结果显示，淫羊藿中活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿A、朝藿定B 和巴戟天中活性成分蔗果四糖、低聚七糖均为治疗支气管哮喘的关键活性成分。其中淫羊藿苷可明显减轻气道炎症反应、改善哮喘症状[7,10]。现代药理研究证实朝藿定B具有祛痰平喘的作用[11]；淫羊藿次苷I、淫羊藿A、蔗果四糖、低聚七糖度值大、类药性高，能与多个支气管哮喘靶点相互作用，提示这4 种活性成分可能是喘可治注射液治疗支气管哮喘的关键活性成分。由PPI 和分子对接验证得到TNF、PTGS2、VEGFA、STAT3、ADRA2A 为喘可治注射液治疗支气管哮喘的关键靶点。TNF-α 是哮喘气道中的前炎症细胞因子，也是哮喘炎症过程中的重要启动因子[12]。TNF-α可通过调控细胞因子、黏附分子和黏液素的表达和释放，增强局部血管通透性，促进支气管炎症介质释放和炎症介质之间相互作用，其水平越高，表明病情越严重[13-14]。PTGS 又称环加氧酶，诱导型PTGS2 参与花生四烯酸代谢，能诱发哮喘急性发作[15]。马素丽等[16]研究称STAT3 参与儿童支气管哮喘的发生和进展，对哮喘的气道炎症具有一定的调节作用。Guan 等[17]发现VEGFA 不论在轻中度哮喘组与正常组还是重度哮喘组与正常组均是蛋白质相互作用网络中的枢纽蛋白，提示VEGFA 可能与哮喘的发病有重要关系。

本研究通过分析得到13 条与支气管哮喘有关的KEGG 通路和12 条GO 生物过程。其中PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中，Durham 等[18]认为PI3K可能通过刺激Akt 活化而进一步促进关键基因TNF表达，从而参与到哮喘的炎症反应中。实验发现，哮喘发生时缺氧诱导因子1、VEGF 表达水平均明显升高，从而使嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞及细胞因子聚集参与气道炎症、气道重塑等过程，促进哮喘的发生发展[19]。MAPK 信号通路是参与支气管哮喘发病及进展的一条重要通路，通过调控免疫/炎症细胞和气道结构细胞，引起气道高反应和气道重塑，最终诱发支气管哮喘[20]。本研究发现ErbB、T 细胞受体等信号通路也可能与支气管哮喘发生机制有关，但尚需进一步论证。以上通路可能参与炎症反应的调节、一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）1 和ERK2 级联的正调控、T 细胞凋亡的调节等多个生物过程从而协同发挥作用。ERK包括两种异构体ERK1 和ERK2，杨季国等[21]发现ERK1/2 在支气管哮喘气道重塑中起重要作用。一氧化氮是由体内半必需氨基酸左旋-精氨酸在一氧化氮合成酶作用下合成的，一氧化氮在哮喘发病中具有双刃剑作用：小剂量的一氧化氮可舒张支气管平滑肌，而高水平的一氧化氮则表现为炎症及细胞毒性[22]。核因子κB 通过参与气道重塑及炎症反应，在支气管哮喘发病过程中起一定作用[23]。结合文献报道与网络药理学方法说明喘可治注射液能从抗炎、抗凋亡、调节增殖等方面治疗支气管哮喘。

综上所述，喘可治注射液中的关键活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿A、朝藿定B、蔗果四糖、低聚七糖可作用于TNF、PTGS2、VEGFA、STAT3、ADRA2A 等关键靶点，调节MAPK 等通路和参与炎症反应调节等生物过程，起到治疗支气管哮喘的作用，为后续实验论证提供了思路、奠定了基础。