沉默SNAI1 对口腔鳞状细胞癌细胞生物活性的影响

武艳飞，杨卫平，邵莉

湖州市第一人民医院口腔科，浙江湖州 313000

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）约占口腔恶性肿瘤的90%。在过去的20 年中，OSCC 的治疗手段有所进展，但OSCC 患者的5年生存率仍不足55%[1]。转录因子SNAI1 为转录抑制因子Snail 家族成员之一，目前普遍认为，SNAI1可通过调控下游靶基因上皮钙黏素（E-cadherin）等的表达介导肿瘤细胞发生上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT），促进肿瘤的迁移与侵袭。相关文献证实，SNAI1 在黑色素瘤、结肠癌、胃癌、肝癌、口腔鳞癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤中高表达[2-8]。但SNAI1 在OSCC 中的研究较少，本研究通过沉默转录因子SNAI1 观察其在OSCC Tca8113 细胞中的表达情况及对OSCC Tca8113 细胞生物活性的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞

人舌鳞癌细胞Tca8113（货号：BFN60700396）购买于BFB 生命科学有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM 培养基（货号：10567014）、胎牛血清（fetal boyine serum，FBS）（货号：SH30080.03）、0.25%胰酶消化液（货号：SH30042.01）均购自美国Gibco 公司；脂质体LipofectamineTM2000（Invitrogen，美国，货号：11668027）；MTT 检测试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒（上海嵘崴达实业有限公司，货号：23250、4890-025-K）；SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Kit（Perfect Real Time）（TAKARA公司，日本，货号：RR820A、RR047AA）；膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-fluoresceinisothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒（BD 公司，美国，货号：556547）；GAPDH 兔多抗（Bioworld 公司，美国）；兔抗SNAI1、兔抗胱天蛋白酶3（caspase-3)、兔抗基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9（Abcam，美国，货号：ab216347、ab13748、ab92536、ab228402）；兔抗Bax、兔抗c-Myc、兔抗Bcl-2、兔抗cyclin D1（R&DSYSTEMS，美国，货号：MAB846、MAB3696、MAB8272、MAB4314）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（Santa Cruz 公司，美国，货号：sc2004）；SNAI1 shRNA（sh-SNAI1）及其阴性对照（sh-control）（上海生工生物公司）。

流式细胞仪（BD 公司，美国）；酶联免疫标记分析仪（雷勃Multiskan MK-3，芬兰）；CO2培养箱（SHEL-LAB 公司，美国）；荧光定量聚合酶链反应仪（ABI 公司，美国）；倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 Tca8113 细胞复苏后，将其置于10% FBS DMEM 培养基中，在37℃、含5%CO2的培养箱中培养。

1.3.2 细胞转染与实验分组 实验分为 3 组：Tca8113 细胞组、sh-control 组、sh-SNAI1 组，其中sh-control 组、sh-SNAI1 组分别用 sh-control、sh-SNAI1 转染Tca8113 细胞，而Tca8113 细胞组不作任何处理，转染48h 后进行检测。

1.3.3 MTT 法检测Tca8113 细胞增殖 Tca8113 细胞调整为1×105个/ml，将其接种于96 孔板（100μl/孔），48h 后，添加MTT 溶液10μl，4h 后，每孔添加二甲基亚砜150μl，充分混匀，酶标仪检测492nm波长处的光密度（optical density，OD）值。细胞存活率=实验组OD 值/对照组OD 值×100%。

1.3.4 流式细胞术检测Tca8113 细胞凋亡 各组Tca8113 细胞培养24h 后，依据Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书的操作方法，先加入5μl Annexin V-FITC，再加入5μl PI，室温条件下避光反应20min，使用流式细胞仪观察各组Tca8113 细胞凋亡情况。

1.3.5 Transwell 实验检测Tca8113 细胞侵袭能力首先在小室内加入100μl 稀释好的Matrigel 基质胶放置超净台紫外线消毒杀菌过夜，在小室上部加入200μl 无血清培养基，下室中加入600μl 含10% FBS的DMEM 高糖培养液，48h 后弃去24 孔板下室中的培养基，加入无水乙醇对细胞进行固定，结晶紫染色，轻轻擦掉未侵入基质胶中的Tca8113 细胞，显微镜下观察并记录侵袭细胞个数，取平均值。

1.3.6 划痕愈合实验评估Tca8113 细胞迁移能力Tca8113 细胞以l×106cell/ml 的浓度接种于6 孔板，使用10μl 枪头进行划线，分别在0h 和24h 观察拍照记录同一位置的划痕宽度，并依据公式[划痕愈合率=（0h 划痕宽度-24h 划痕宽度）／0h 划痕宽度×100%]计算划痕愈合率。

1.3.7 实时荧光定量聚合酶链反应检测 SNAI1 mRNA 表达水平 利用Trizol 一步法进行RNA 提取；取1μl RNA 利用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA。采用SYBR Green 试剂盒评价SNAI1 mRNA表达水平。循环条件如下：94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 20s 和72℃ 40s，35 个循环，最后72℃ 5min。引物序列：SNAI1 正向引物5'-TTCTTCTGCGCTA CTGCTGCG-3'，反向引物5'-GGGCAGGTATGGAG AGGAAGA-3'；GAPDH 正向引物5'-GCACCGTCAA GGCTGAGAAC-3'，反向引物5'-TGGTGAAGACGC CAGTGGA-3'。

1.3.8 蛋白质印迹法检测SNAI1、c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平 按照实验分组处理细胞后48h，收取各组细胞，分别加入蛋白裂解液进行总蛋白提取。用BCA蛋白试剂盒检测其蛋白浓度，于99℃进行蛋白变性，并进行10% SDS 凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封膜1h，分别添加兔抗SNAI1（1∶500）、c-Myc（1∶1000）、cyclin D1（1∶200）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶1000）、caspase-3（1∶500）、MMP-2（1∶200）、MMP-9（1∶200）4℃下过夜孵育，次日添加兔二抗（1∶5000）孵育膜1h，再使用ECL 底物进行显色，Image J 软件进行定量分析。实验重复3 次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行数据统计分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，符合正态分布及方差齐性的采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Tca8113 细胞中SNAI1 mRNA 表达水平

sh-control组和Tca8113细胞组中SNAI1 mRNA表达水平比较差异无统计学意义[（1.07±0.14）vs.（1.06±0.13），P＞0.05]；但与sh-control 组相比，sh-SNAI1 组中SNAI1 mRNA 表达水平显著降低[（1.07±0.14）vs.（0.51±0.08），P＜0.05]。

2.2 沉默SNAI1 对细胞存活率的影响

sh-control 组与Tca8113 细胞组的细胞存活率和c-Myc、cyclin D1 蛋白表达比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；但与sh-control 组相比，sh-SNAI1 组的细胞存活率和c-Myc、cyclin D1 蛋白表达均显著降低（P＜0.05），见图1、表1。

图1 各组增殖相关蛋白条带图

表1 沉默SNAI1 对Tca8113 细胞增殖的影响（）

表1 沉默SNAI1 对Tca8113 细胞增殖的影响（）

注：与sh-control 组比较，*P＜0.05

2.3 沉默SNAI1 对细胞凋亡的影响

sh-control 组和Tca8113 细胞组的细胞凋亡率和Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表达比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；sh-SNAI1 组的细胞凋亡率和Bax、caspase-3 蛋白表达显著高于sh-control组（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达显著低于sh-control组，见图2、表2。

表2 沉默SNAI1 对Tca8113 细胞凋亡的影响（）

表2 沉默SNAI1 对Tca8113 细胞凋亡的影响（）

注：与sh-control 组比较，*P＜0.05

图2 各组凋亡相关蛋白条带图

2.4 沉默SNAI1 对Tca8113 细胞迁移能力的影响

sh-control 组和Tca8113 细胞组的划痕愈合率比较差异无统计学意义[（26.38±2.53）%vs.（25.66±2.37）%，P＞0.05]；与sh-control 组比较，sh-SNAI1 组的划痕愈合率显著降低[（26.38±2.53）%vs.（10.36±1.53）%，P＜0.05]，见图3。

图3 划痕试验检测各组细胞的迁移能力（×100）

2.5 沉默SNAI1 对Tca8113 细胞侵袭能力的影响

sh-control 组和Tca8113 细胞组的侵袭细胞数比较差异无统计学意义[（165.77±12.16）个vs.（164.89±12.55）个，P＞0.05]；与 sh-control组比较，sh-SNAI1 组的侵袭细胞数显著减少[（165.77±12.16）个vs.（80.13±11.37）个，P＜0.05]，见图4。

图4 Transwell 实验检测各组细胞侵袭能力（结晶紫染色，×200）

2.6 沉默SNAI1 对Tca8113 细胞SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达的影响

sh-control 组和Tca8113 细胞组的SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；与sh-control 组比较，sh-SNAI1 组的SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），见图5、表3。

图5 各组SNAI1 蛋白及侵袭迁移相关蛋白条带图

表3 沉默SNAI1 对SNAI1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响（）

表3 沉默SNAI1 对SNAI1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响（）

注：与sh-control 组比较，*P＜0.05

3 讨论

OSCC 是常见的恶性肿瘤，尽管治疗手段取得较大进展，但OSCC 患者的存活率仍低于50%[9-10]。OSCC 发病机制复杂，至今尚未完全明确。

SNAI1 作为关键的EMT 调节因子，在侵袭和转移中发挥重要作用，主要与SNAI1 抑制E-cadherin表达而介导上皮细胞向间充质细胞转化有关[11]。在骨肉瘤细胞研究中，miR-153 通过靶向抑制SNAI1控制肿瘤细胞的浸润、迁移和EMT[12]。在乳腺癌MCF7 细胞中，沉默SNAI1 可影响EMT 相关蛋白表达，减弱肿瘤的扩散、迁移和侵袭能力[13]。此外，值得注意的是，在OSCC 细胞系SCC-9 和HSC-4 的细胞研究中，核粒梭菌可通过上调SNAI1 表达，促进OSCC 细胞中EMT 转化[14]。另外，Yang 等[15]研究发现SNAI1 在OSCC 组织中高表达，且与T 分期、淋巴结转移、临床分期和分化程度有关，与Song 等[16]研究结果相吻合，对OSCC 的临床诊断、预后预测和靶向治疗具有重要的理论参考价值。基于以上研究，当细胞转染sh-SNAI1 后，SNAI1 mRNA 表达水平显著降低，细胞存活率、划痕愈合率与侵袭细胞数显著降低，凋亡率显著升高，Tca8113 细胞增殖、迁移、侵袭均降低，促进细胞凋亡；蛋白质印迹法检测结果显示，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、c-Myc、Bcl-2 水平显著降低，细胞凋亡蛋白caspase-3、Bax水平显著升高，进一步表明沉默 SNAI1 可抑制Tca8113 细胞的恶性行为。

综上所述，沉默SNAI1 可抑制OSCC 的增殖、侵袭与迁移，促进细胞凋亡，为OSCC 的诊治提供新靶点，但由于机制复杂，单一细胞研究存在不足之处，后续将进一步研究以证实。