鹤顶兰(Phaius tancarvilleae)杂交亲和力

陈伦妍, 郑忠禄, 冀宏宇, 陆艾鲜, 林子润, 成 果, 黄元贞, 吴沙沙, 翟俊文

(1.福建农林大学风景园林与艺术学院,福建 福州 350002;2.兰科植物保护与利用国家林业和草原局重点实验室,福建 福州 350002;3.厦门大学环境与生态学院,福建 厦门 361005;4.漳州城市职业学院,福建 漳州 363000)

鹤顶兰(Phaiustancarvilleae)是兰科(Orchidaceae)鹤顶兰属(Phaius)多年生草本植物,是热带、亚热带地区较为常见的大型野生兰.我国有10余个鹤顶兰属原生种,分布于西南和华南各省区[1],种质资源较丰富.该属植物的花具有较高的观赏价值,花朵大且数量多,花色艳丽且变化丰富,可作盆花、切花,亦可在庭院、公园等较荫处栽培和造景[2-3].但该属植物种质资源在相当长时间内未受到重视,许多仍处于野生状态,其基础性研究和园林利用还比较滞后,育种工作进展缓慢,新品种种类少,无法满足市场需求,导致大量野生种被采挖贩卖,野生资源面临巨大灾难[4].此外,由于赖以生存的自然环境恶化[5]、人为过度采挖,野生种群数量不断减少,致使许多地生种类的鹤顶兰属处于濒危状态[6].

杂交是应用最广的植物育种方法[7-8].国外鹤顶兰属杂交育种工作很早之前就已开展,例如,美国培育的鹤顶虾脊兰‘烈火战车’PhaiocalantheKryptonite ‘Chariot of Fire’(CalantheRozel×Phaiustancarvilleae)已在全世界范围内上市和广泛栽培.由鹤顶兰与虾脊兰属间杂交育成的鹤虾兰‘厄苏拉’(PhaiocalantheKryptonite ‘Ursula’)和鹤虾兰‘梦想’(Phcal.Kryptonite ‘Leatha’s Dream’),以及由鹤顶兰与杂种虾脊兰异属杂交育成的鹤虾兰‘东京午夜’(Phcal.Kryptonite ‘Tokyo Midnight’)市场价值均较高[9].目前鹤顶兰属杂交亲和力的相关研究较少.研究表明[10],鹤顶兰与黄花鹤顶兰杂交可以顺利产生后代并开花,且F1代花朵性状与亲本相似但又存在差异;紫花鹤顶兰和鹤顶兰的正反交试验结果表明,非共生萌发获得的杂交后代幼苗生长良好且性状优于亲本[11].

国内对鹤顶兰属植物杂交育种的相关研究较少.英国皇家园艺学会(Royal Horticultural Society, RHS)共登录81个鹤顶兰属杂交组合,我国育种学家登录的杂交组合仅2个:鹤顶兰‘孔雀开屏’(Phaius‘Fragrant Peacock’)、鹤虾兰‘粉色回忆’(Phcal‘Pink Memory’).此外,有报道的新品种还有鹤顶兰‘紫唇’和鹤顶兰‘秋香’[12](Phaius‘Autumn Fragrance’),但未见登录或相关认定文件,市场上也未能获得相关活体.

本试验进行鹤顶兰属种间和属间共6个组合的杂交试验,以探究鹤顶兰的杂交亲和力,从而为筛选合适的杂交亲本、缩短育种周期提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

杂交所用植株栽培于福建农林大学森林兰苑(图1).杂交亲本包括鹤顶兰、黄花鹤顶兰(P.flavus)、三褶虾脊兰(Calanthetriplicata)和银带虾脊兰(C.argenteostriata)、中越鹤顶兰(P.tonkinensis)、保禄鹤顶兰(P.tancarvilleaevar.baolocensis).

A:鹤顶兰;B:黄花鹤顶兰;C:三褶虾脊兰;D:银带虾脊兰;E:保禄鹤顶兰;F:中越鹤顶兰.

1.2 杂交组合与授粉

授粉试验分2批进行(表1).第1批于2021年4—5月进行,包括鹤顶兰自花授粉、鹤顶兰×黄花鹤顶兰、鹤顶兰×三褶虾脊兰、银带虾脊兰×鹤顶兰,授粉所用花粉现采现用.第2批于2021年10月进行,即中越鹤顶兰×银带虾脊兰、中越鹤顶兰×保禄鹤顶兰,授粉所用花粉于2021年3—5月收集,放置于-80 ℃冰箱干燥贮存[13].

表1 杂交方法1)

选取长势良好的植株作为母本,每株选取2～3朵花进行授粉,每个杂交组合选择30朵花进行授粉.母本花朵在花蕾期含苞待放时取下花粉,去除唇瓣并套袋.母本花朵绽放1～2 d时,将父本花粉置于母本柱头上并套袋,挂上标签(记录杂交亲本和杂交时间).在授粉75～90 d后采收蒴果,此时蒴果表皮由绿色开始转为黄色,完好未开裂.采集的蒴果置于4 ℃干燥贮存.

1.3 蒴果与种子形态观察

每个杂交组合选取6个授粉后发育良好的成熟蒴果,共计36个.用蒸馏水漂洗蒴果表面2～3次,自然干燥后,观察蒴果外部形态.从每个蒴果内取出约100粒种子置于载玻片上,利用光学显微镜进行形态观察,并采用Micrometrics SE Premium软件测量种子的长度和宽度,计算其长、宽平均值.

1.4 种子有胚率与着色率检测

上述选取的36个成熟蒴果中,每个蒴果取约100粒种子,放入离心管中,加入1%TTC(体积分数)溶液,轻微振荡,确保所有种子被浸没,再用锡箔纸包裹离心管,置于30 ℃恒温环境染色11～12 h,利用体视显微镜观察种子着色情况并记录.每个处理均重复3次.在随机的3个视野中分别统计每个视野中的有胚种子数、种胚着色种子数和视野内种子总数,用于计算种子有胚率和着色率.有胚率/%=(视野中有胚种子数/视野内种子总数)×100;着色率/%=(视野中着色种子数/视野内种子总数)×100.

1.5 种子萌发率检测

清理蒴果表面的泥沙等杂质后,用75%乙醇擦拭蒴果表面,再将其放入带盖空玻璃瓶内,加入10 g洗衣粉,并加水振荡,后覆上一层纱布,置于流水中冲洗0.5 h.在无菌环境下,利用75%乙醇(体积分数,消毒2 min)和10%次氯酸钠(体积分数)溶液(消毒10 min)对蒴果外表进行消毒.用无菌镊子夹取部分种子,均匀播撒在萌发培养基(2.00 g·L-1Hyponex 1+1/2 MS+0.37 mg·L-1MgSO4·7H2O+25.00 g·L-1蔗糖+1.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1KT+5.50 g·L-1琼脂粉+1.50 g·L-1活性炭+2.00 g·L-1牛肉粉蛋白胨+50 g·L-1洋葱,pH 5.7～5.8)[14]表面,每瓶培养基均匀播撒约300粒种子.每个蒴果接种约30瓶.

先进行30 d的暗培养,温度为24 ℃;30 d后光周期调整为每天12 h,光照强度为1 000～1 500 lx,培养120～150 d.种子萌发后,每7 d对组培苗进行观察.采用光学显微镜观察萌发情况,萌发前每14 d观察1次,萌发阶段每3～4 d观察1次,记录种子萌发时间、萌发过程中发生的形态变化和萌发率.当培养基表面出现肉眼可见的白色或绿色凸起时,即可视为萌发,计算播种后180 d内的种子萌发率[14].每瓶培养基选取5个单位面积(1 cm×1 cm)的样方,在光学显微镜下观测,上述步骤重复3次.萌发率/%=(单位样方面积的萌发种子数/供试种子总数)×100.

1.6 数据统计与处理

数据统计与处理采用SPSS 22.0软件,分析不同杂交组合的种子长度、宽度、有胚率、TTC着色率和萌发率的差异显著性.

2 结果与分析

2.1 蒴果与种子的形态特征

前4个杂交组合所得蒴果为褐色,后2个组合蒴果为青绿色(图2).6个组合的果荚具有以下共同特征:表皮隆起、具纵条纹、两端狭长成线、中部较大呈凸起状,总体呈“两头小中间大”的形状.

6个杂交组合所得种子都极为细小,颜色为浅褐色,大小似尘埃,整体形状多为长条形和披针形(图2G-L).鹤顶兰自花授粉、银带虾脊兰×鹤顶兰组合种子均为狭长形,长度较长、两头狭窄、中间稍宽.鹤顶兰×黄花鹤顶兰、中越鹤顶兰×银带虾脊兰、中越鹤顶兰×保禄鹤顶兰组合种子为长椭圆形,整体形状与鹤顶兰自花授粉种子相似.而鹤顶兰×三褶虾脊兰组合所得种子为长圆柱形,与其余组合存在显著差异.

G-L放大倍数为25倍.A:鹤顶兰自花授粉所得蒴果;B:鹤顶兰×黄花鹤顶兰蒴果;C:鹤顶兰×三褶虾脊兰蒴果;D:银带虾脊兰×鹤顶兰蒴果;E:中越鹤顶兰×银带虾脊兰蒴果;F:中越鹤顶兰×保禄鹤顶兰蒴果;G:鹤顶兰自花授粉所得种子;H:鹤顶兰×黄花鹤顶兰种子;I:鹤顶兰×三褶虾脊兰种子;J:银带虾脊兰×鹤顶兰种子;K:中越鹤顶兰×银带虾脊兰种子;L:中越鹤顶兰×保禄鹤顶兰种子.

对6个组合所得种子的长度、宽度进行测量(表2).结果表明,鹤顶兰不经处理所得种子的长度为900～2 200 μm,宽度为160～370 μm.鹤顶兰自花授粉、鹤顶兰×黄花鹤顶兰、银带虾脊兰×鹤顶兰的种子长度均大于鹤顶兰未处理组.在6个组合中,只有鹤顶兰×三褶虾脊兰、中越鹤顶兰×银带虾脊兰的种子宽度小于鹤顶兰未处理组.因此,鹤顶兰×黄花鹤顶兰、银带虾脊兰×鹤顶兰、中越鹤顶兰×保禄鹤顶兰的种子长度、宽度与鹤顶兰自花授粉种子相似,鹤顶兰×三褶虾脊兰、中越鹤顶兰×银带虾脊兰的种子长度、宽度与其他组合的差异显著.

表2 6个杂交组合种子的长宽值、有胚率及着色率(n=20)

2.2 种子有胚率与着色率

方差分析表明,不同杂交组合所得种子的有胚率和着色率存在显著差异(表2).银带虾脊兰×鹤顶兰的种子有胚率最高,与鹤顶兰自花授粉组合种子差异较小,中越鹤顶兰×银带虾脊兰的种子有胚率最低;中越鹤顶兰×保禄鹤顶兰的种子着色率最高,其余组合的着色率总体偏低,鹤顶兰×黄花鹤顶兰与鹤顶兰自花授粉的种子着色率差异最小,中越鹤顶兰×银带虾脊兰的种子着色率最低.

6个杂交组合中,鹤顶兰自花授粉、鹤顶兰×三褶虾脊兰、银带虾脊兰×鹤顶兰的种子有胚率均与着色率呈现负相关.差异最大的是银带虾脊兰×鹤顶兰,虽然有胚率最高(98.2%),但着色率较低(12.1%),可能是种胚死亡或生命力衰退所致.中越鹤顶兰×银带虾脊兰的种子有胚率和着色率均最低,种子活力也最低.

2.3 种子萌发率

方差分析表明,不同杂交组合所得种子的萌发率差异极显著(图3、表3).萌发率最高的是鹤顶兰×黄花鹤顶兰,达77.4%;中越鹤顶兰×银带虾脊兰的种子萌发率最低,为1.2%;鹤顶兰×三褶虾脊兰与中越鹤顶兰×银带虾脊兰的种子萌发率差异不显著.鹤顶兰以及鹤顶兰属内杂交的种子萌发率比鹤顶兰属与虾脊兰属间杂交高25.5%～76.2%.

表3 6个杂交组合种子的萌发率(n=20)

A:鹤顶兰自花授粉;B:鹤顶兰×黄花鹤顶兰;C:鹤顶兰×三褶虾脊兰;D:银带虾脊兰×鹤顶兰.

3 讨论与结论

与鹤顶兰未处理组所得种子的长度、宽度相比,鹤顶兰×黄花鹤顶兰的种子膨大程度最高且最饱满.杂交所得种子的有胚率、着色率和萌发率是判断杂交种子活力的重要标准,也是反映父母本杂交亲和力强弱的重要指标.不同杂交组合所得种子的活力差异显著.李玉萍等[15]以4个建兰(Cymbidiumensifolium)品种为母本,杂交兰(Cymbidiumhybridum×faberi)和大花蕙兰(Cymbidiumfaberi×hybridum)为父本进行杂交,将杂交种子置于较适宜的1/2 MS基本培养基中进行萌发试验,各杂交组合的萌发率最高达87.5%,最低为33.3%.

本试验中,虽然银带虾脊兰×鹤顶兰的种子有胚率高于鹤顶兰×黄花鹤顶兰,但前者的着色率低于后者.综合有胚率和着色率分析,鹤顶兰×黄花鹤顶兰的种子活力强于银带虾脊兰×鹤顶兰.萌发率结果表明,鹤顶兰×黄花鹤顶兰的种子萌发率最高(77.4%),高于鹤顶兰自花授粉所得种子的萌发率(52.9%),萌发率最低的是中越鹤顶兰×银带虾脊兰(1.2%).综合所有指标分析,鹤顶兰×黄花鹤顶兰的亲本间杂交亲和力最强,且子代的性状也优于亲本.有研究表明[16],鹤顶兰与黄花鹤顶兰杂交,F1代遗传性状稳定,繁殖系数、花产量明显著高于父母本,且具有周年开花和花香的特点,出现超亲遗传现象,该结果与本试验结果相似.

本试验结果表明,鹤顶兰属内种间杂交亲和力高于其与虾脊兰属植物属间杂交的亲和力,这与前人研究结论相似[17-19],亲缘关系较近的亲本间杂交,杂交亲和力则较强.鹤顶兰×三褶虾脊兰、银带虾脊兰×鹤顶兰、中越鹤顶兰×银带虾脊兰的亲和力弱于鹤顶兰×黄花鹤顶兰、中越鹤顶兰×保禄鹤顶兰,这种差异是由亲缘关系造成的,说明通过以鹤顶兰属植物为母本、虾脊兰属植物为父本进行杂交从而培育出新品种是可行的,但属间杂交亲和力显著低于属内种间杂交的亲和力.在兰属植物种间杂交育种中,由于国兰之间的亲缘关系近于国兰与大花蕙兰之间的亲缘关系,前者的杂交亲和力显著高于后者的杂交亲和力[20].

本试验结果表明,鹤顶兰×三褶虾脊兰、中越鹤顶兰×银带虾脊兰的种子活性极低,亲本间杂交亲和力也较低,出现杂交不亲和现象.在墨兰(Cymbidiumsinense)品种×大花蕙兰品种的杂交试验和以建兰品种为母本、杂交兰品种和大花蕙兰品种为父本的杂交试验中,也均出现了杂交不亲和现象:所有杂交组合的子房虽均有不同程度的膨大,但子房膨大后1个月内不断有较小的果实黄化脱落,直至授粉后3个月内仍有果实变黄逐渐脱落[21],这可能与远缘杂交中存在合子后隔离(也称受精后障碍)有关[22].造成杂交不亲和现象的原因有很多,如父本的花粉活力[23]、柱头可授性、父母本染色体数量或倍性差异[24]以及某些复杂的不亲和体系等,具体原因还需进一步探究.此外,有研究表明,建兰×杂交兰的亲和力较强,但杂交兰×建兰的亲和力较弱[25],说明二者的杂交亲和力可能具有单向性.在石斛兰组内和组间杂交时发现,大部分杂交组合只能通过单向杂交结实[26].而这种单向性在鹤顶兰属中是否存在,还需进一步研究.

综上所述,本试验得出以下结论:(1)鹤顶兰×黄花鹤顶兰组合所得后代,在外部形态、着色率、萌发率方面均优于鹤顶兰同株自花授粉,说明鹤顶兰与黄花鹤顶兰的亲和力较强;(2)鹤顶兰与虾脊兰属植物进行属间杂交培育新品种的方法是可行的,但是其杂交亲和力显著低于属内种间杂交亲和力.