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丹参素对胃癌AGS细胞凋亡的影响及其机制研究*

2023-05-13周桂香郭小峰

中医药导报 2023年4期
关键词:抑制率细胞周期丹参

邓 帅,周桂香,郭小峰,谭 宝

(1.山西中医药大学,山西 太原 030024;2.山西省中医院,山西 太原 030000)

胃癌在人类消化系统癌症中较为普遍,其发病率和死亡率均高居不下。在全球范围内,胃癌的发生率约占全部肿瘤病例的5.6%,排于世界第五位;死亡率低于肺癌、结直肠癌、肝癌,位列世界第四位[1]。近年来,研究[2]发现丹参内的生物活性成分具有抗肿瘤的作用,并对胃癌也有较好的抑制效果。丹参素是丹参内的生物活性成分之一,在体内能够发挥抗氧化、消炎、抑癌、活血化瘀等药理作用[3]。已有实验证明丹参素对胃癌具有抑制作用,但对其作用机制尚不清楚[4],本研究旨在探讨丹参素对人胃腺癌AGS细胞凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人胃腺癌AGS细胞株,受赠于上海中医药大学课题组。

1.2 试剂及仪器 DMEM培养基(批号:MA0212)、CCK8试剂盒(批号:SC119-02)均购买于正合生物公司;顺铂注射液(批号:601210605)购买于江苏豪森药业;丹参素标准品(批号:MUST-21060920)购买于成都曼斯特生物科技公司;BCA蛋白浓度测定试剂(批号:16H10A46)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(变性)(5X)(批号:16J20B12)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(批号:16J27C38)均购买于博士德生物公司;胎牛血清(批号:21090706)购买于四季青生物公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号:Jan-18G)、Mei Lunbio飞克特超敏EGL发光液(批号:MA0186-Sep-17G)均购买于大连美伦公司;细胞周期染色试剂盒(批号:A10734)购买于北京联科公司;Bax、BCL-2抗体(批号:3560006120、3560138106)均购买于thermo公司。

TD5A-WS型低速离心机(中科中佳有限公司);DYY-2C型电泳仪(北京六一公司);RT-6100型酶标仪(MoLecuLar Devices公司);BD-C6型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司);DYCZ-40D型转膜仪(北京六一公司);3111型细胞恒温培养箱(thermo公司);CJ-2F型超净工作台(北京东联哈尔公司)。

1.3 药物配制 于电子天平上准确称取4 mg丹参素标准品,溶解于DMEM培养基中,配得200 μg/mL的丹参素溶液,按浓度稀释,得到丹参素浓度为25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的溶液。

1.4 胃癌AGS细胞培养 用DMEM培养基(含10%胎牛血清、1%双抗)培养人胃癌AGS细胞,将其放于恒温箱中生长(温度为37 ℃,CO2含量为5%),传代条件为培养液颜色变浅或细胞贴至瓶底70%~100%。

1.5 细胞增殖抑制率检测 将胃癌AGS细胞按6×104/mL的密度接种在96孔板内,每孔放置100 μL细胞悬液,待其贴壁后,分别给予浓度为0 μg/mL(空白组)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹参素溶液及浓度为5 μg/mL的顺铂注射液溶液(阳性组)各100 μL,另取5个副孔只加入100 μL培养基,设为空白对照组,放于恒温箱24、48 h后,加入110 μL的CCK-8工作混合液,放于恒温箱孵育30 min,在酶标仪上测出450 nm处光密度(opticaL density,OD)值后,计算其抑制率。抑制率=[OD(Ac)-OD(As)]/[OD(Ac)-OD(Ab)]×100。As(含药组,含有药物、细胞、CCK8溶液、培养基),Ab(空白对照组,含有培养基、CCK8溶液,不含药物及细胞),Ac(空白组,含有细胞、培养基、CCK8溶液,不含药物)。实验重复3次。

1.6 细胞周期检测 将胃癌AGS细胞按2×105/mL的密度接种在6孔板内,每孔放置2 mL细胞悬液,待其贴壁后,分别给予浓度为0 μg/mL(空白组)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹参素溶液各2 mL,干预胃癌AGS细胞24 h、48 h后,胰酶消化、离心、PBS重悬、最后使用预冷的无水乙醇固定细胞。在检测时离心细胞,弃去含有无水乙醇的上清液,加入2 mL的PBS静置15 min后离心,吸出上清液并丢弃,加入1 mL DNA staining solution后放于暗处避光30 min后上机检测细胞周期。实验重复3次。

1.7 细胞凋亡检测 将胃癌AGS细胞按2×105/mL的密度接种在6孔板内,每孔放置2 mL细胞悬液,待其贴壁后,分别给予浓度为0 μg/mL(空白组)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹参素溶液各2 mL,干预胃癌AGS细胞24 h、48 h后,分别进行以下步骤操作:胰酶消化、离心、弃上清液、加预冷PBS后离心、弃上清液、加200 μL Bing Buffer重悬细胞、吸取一半重悬细胞放于流式管中、加入5 μL AV和10 μL PI、避光15 min、加入400 μL Bing Buffer后上机检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.8 Western blotting检测蛋白表达情况 将胃癌AGS细胞按4×105/mL的密度接种在6孔板内,每孔放置2 mL细胞悬液,待其贴壁后,分别给予浓度为0 μg/mL(空白组)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹参素溶液及浓度为5 μg/mL的顺铂注射液(阳性组)各2 mL干预胃癌AGS细胞,放于恒温箱培养24 h后对细胞进行收集,于冰上对细胞进行裂解,裂解完成后在低温离心机上进行离心,待结束后对蛋白进行提取并对所得蛋白定量分析,煮沸并收集变性蛋白,计算上样量。然后按照配胶、上样、电泳、转PVDF膜这一顺序收集转膜成功的PVDF膜,将膜放于牛奶中封闭,于2h后用TBST每隔10 min对其进行清洗,共计3次,加入稀释500倍的一抗后放于4 ℃冰箱过夜,第2天依法洗膜3次放于稀释5 000倍的二抗中,1 h后依法洗膜3次,最后加入ECL发光液行显影分析。

1.9 统计学方法 从Excel数据表中导入数据信息,用SPSS 25.0软件统计分析,计量数据使用“均数±标准差”表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 丹参素对胃癌AGS细胞增殖抑制率的影响 除空白组外,丹参素同一浓度不同时间段对胃癌AGS细胞均具有抑制作用,其抑制率随着药物的作用时间延长而逐渐升高(P<0.05),说明丹参素对胃癌AGS细胞的抑制具有时间依赖关系;与空白组比较,低、中、高浓度组的丹参素干预胃癌AGS细胞24 h,可使胃癌AGS细胞抑制率从8.10%上升到24.21%,干预胃癌AGS细胞48h,可使胃癌AGS细胞抑制率从15.24%上升到47.45%(P<0.05),说明丹参素对胃癌AGS细胞的抑制具有浓度依赖关系。阳性组对胃癌AGS细胞的抑制率明显高于高浓度组(P<0.05)。结果表明丹参素干预胃癌AGS细胞24、48 h,能呈剂量和时间依赖性地抑制胃癌AGS细胞的生长。而阳性组对胃癌AGS的抑制率优于丹参素。(见表1)

表1 丹参素对胃癌AGS 细胞增殖抑制率的影响 (x±s,%)

2.2 丹参素对胃癌AGS细胞凋亡的影响 丹参素干预胃癌AGS细胞24 h凋亡率如图1所示,与空白组比较,低、中、高浓度组丹参素干预胃癌AGS细胞后凋亡率分别为6.4%、12.2%、23.8%;干预胃癌AGS细胞48 h凋亡率如图2所示,与空白组比较,低、中、高浓度组丹参素干预胃癌AGS细胞后凋亡率分别为12.7%、21.1%、52.5%。结果表明,丹参素对胃癌AGS细胞有促凋亡作用,其凋亡率随着丹参素浓度的增加而升高(P<0.05)。

图1 丹参素对胃癌AGS 细胞凋亡的影响(24 h)

图2 丹参素对胃癌AGS 细胞凋亡的影响(48 h)

2.3 丹参素对胃癌AGS细胞周期的影响 丹参素干预胃癌AGS细胞24 h,对其周期影响如图3所示,与空白组比较,低、中、高浓度组的丹参素对胃癌AGS细胞G2/M期具有抑制作用,能够使G2/M期细胞数目显著增加,其抑制率从27.14%上升到50.26%(P<0.05)。丹参素干预胃癌AGS细胞48 h,对其周期影响如图4所示,与空白组比较,低、中、高浓度组的丹参素对胃癌AGS细胞G2/M期具有抑制作用,能够显著抑制G2/M期的细胞数,其抑制效果从40.94%上升到73.55%(P<0.05)。结果表明,丹参素干预胃癌AGS细胞后能将其周期阻滞于G2/M期。

图3 丹参素对胃癌AGS 细胞周期的影响(24 h)

图4 丹参素对胃癌AGS 细胞周期的影响(48 h)

2.4 丹参素对胃癌AGS细胞不同蛋白表达的影响 丹参素干预胃癌AGS细胞后对不同蛋白表达的影响如图5所示,与空白组比较,低、中、高浓度组丹参素及阳性组对胃癌AGS细胞Bax、p53、Cytochrome C蛋白的表达具有促进作用(P<0.05),对Bcl-2蛋白的表达具有抑制作用(P<0.05)。与丹参素高浓度组比较,阳性组Bax、Cytochrome C、p53蛋白表达升高明显,Bcl-2蛋白表达降低明显(P<0.05)。结果表明丹参素能够抑制胃癌AGS细胞Bcl-2蛋白的表达,促进Bax、p53、Cytochrome C蛋白的表达,并呈剂量依赖关系。阳性组对胃癌AGS细胞Bcl-2蛋白的抑制效果及对p53、Cytochrome C、Bax蛋白的促进效果较丹参素好。

图5 丹参素对胃癌AGS 细胞不同蛋白表达的影响

3 讨 论

近年来,由于中药抗癌取得了良好的效果,丹参及其有效成分被发现对胃癌具有较好抑制的效果,但大多是对其脂溶性成分的研究,对其水溶性成分的研究较少[5]。由于丹参素是丹参的水溶性成分之一,因此本实验采用丹参素作为实验药物。研究表明丹参素可以通过调控细胞内的信号因子,来抑制癌细胞生长并对癌细胞的凋亡起着积极作用[6-8]。本实验通过CCK8试剂检测证实丹参素可以对胃癌AGS细胞的增殖产生抑制作用,表明丹参素可以抑制胃癌细胞的生长,进一步验证了丹参素具有抗肿瘤作用。

细胞凋亡具有独特的生化和遗传途径,是细胞受到体内多种信号分子影响所发生的一种程序性细胞死亡,在正常组织的发育和体内平衡中起关键作用[9-10]。细胞凋亡受阻可以导致肿瘤发生,调控信号分子可以使细胞凋亡。细胞周期是按照一定顺序在细胞内不断发生的一组事件,细胞能够正常进行生长与分裂是因为细胞能够严格按照G0/G1→S→G2→M这一顺序进行[11-12]。如果细胞周期被阻滞于某一阶段,则会导致细胞增殖分化异常,最终凋亡,这表明周期阻滞是药物发挥抗癌作用的机制之一[13]。杨华等[4]发现丹参素可以通过周期阻滞来促进胃癌细胞凋亡;毕明慧等[14]使用丹参素作用于肝癌细胞后,发现p53高表达对肝癌细胞凋亡起着积极作用;贾金靖等[15]发现丹参素可以通过调控凋亡相关蛋白来控制银屑样细胞凋亡;彭汝琴等[16]通过实验证实丹参素能通过调控Bax、Bcl-2等凋亡蛋白来加速肝星状细胞凋亡。这提示丹参素可以通过多种途径来促进癌细胞的凋亡。在本实验中,将丹参素作用于胃癌AGS细胞后,随着时间的延长和药物浓度的增加,细胞凋亡率增加,G2/M期细胞比例上升,由此推断丹参素能够通过G2/M期阻滞来抑制胃癌AGS细胞生长,诱导细胞凋亡。

Bax、BCL-2蛋白与线粒体凋亡有着密切关联,在促进或抑制线粒体功能障碍引发的内在凋亡途径中起关键作用[17]。研究发现Bax/Bcl-2比值发生变化会使膜电位的稳态受到影响,使线粒体膜电位发生改变,导致与线粒体凋亡密切相关的Cytochrome C从线粒体释放到细胞质与Apaf1结合发生寡聚化,引起Caspase的级联反应,使凋亡程序开始进行,从而引起细胞凋亡的发生[18-23]。有研究[24-25]发现,DNA的损伤会活化p53。这时p53能够作为一个上游基因,调控Bax、Bcl-2蛋白表达来强化线粒体凋亡途径。这表明线粒体凋亡途径有Bax、Bcl-2、Cytochrome C、p53蛋白参与。在本实验中,将丹参素作用于胃癌AGS细胞后,p53、Bax、Cytochrome C蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降,这表明丹参素促进胃癌AGS细胞凋亡可以通过启动线粒体凋亡进行。

综上所述,丹参素能够抑制胃癌AGS细胞的生长,促进胃癌AGS细胞凋亡,其机制与丹参素阻滞细胞于G2/M期、启动线粒体凋亡有关。

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