丹参素对胃癌AGS细胞凋亡的影响及其机制研究*

邓 帅，周桂香，郭小峰，谭 宝

（1.山西中医药大学，山西 太原 030024；2.山西省中医院，山西 太原 030000）

胃癌在人类消化系统癌症中较为普遍，其发病率和死亡率均高居不下。在全球范围内，胃癌的发生率约占全部肿瘤病例的5.6%，排于世界第五位；死亡率低于肺癌、结直肠癌、肝癌，位列世界第四位[1]。近年来，研究[2]发现丹参内的生物活性成分具有抗肿瘤的作用，并对胃癌也有较好的抑制效果。丹参素是丹参内的生物活性成分之一，在体内能够发挥抗氧化、消炎、抑癌、活血化瘀等药理作用[3]。已有实验证明丹参素对胃癌具有抑制作用，但对其作用机制尚不清楚[4]，本研究旨在探讨丹参素对人胃腺癌AGS细胞凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人胃腺癌AGS细胞株，受赠于上海中医药大学课题组。

1.2 试剂及仪器 DMEM培养基（批号：MA0212）、CCK8试剂盒（批号：SC119-02）均购买于正合生物公司；顺铂注射液（批号：601210605）购买于江苏豪森药业；丹参素标准品（批号：MUST-21060920）购买于成都曼斯特生物科技公司；BCA蛋白浓度测定试剂（批号：16H10A46）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（变性）（5X)（批号：16J20B12）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号：16J27C38）均购买于博士德生物公司；胎牛血清（批号：21090706）购买于四季青生物公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（批号：Jan-18G）、Mei Lunbio飞克特超敏EGL发光液（批号：MA0186-Sep-17G）均购买于大连美伦公司；细胞周期染色试剂盒（批号：A10734）购买于北京联科公司；Bax、BCL-2抗体（批号：3560006120、3560138106）均购买于thermo公司。

TD5A-WS型低速离心机（中科中佳有限公司）；DYY-2C型电泳仪（北京六一公司）；RT-6100型酶标仪（MoLecuLar Devices公司）；BD-C6型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）；DYCZ-40D型转膜仪（北京六一公司）；3111型细胞恒温培养箱（thermo公司）；CJ-2F型超净工作台（北京东联哈尔公司）。

1.3 药物配制 于电子天平上准确称取4 mg丹参素标准品，溶解于DMEM培养基中，配得200 μg/mL的丹参素溶液，按浓度稀释，得到丹参素浓度为25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的溶液。

1.4 胃癌AGS细胞培养 用DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）培养人胃癌AGS细胞，将其放于恒温箱中生长（温度为37 ℃，CO2含量为5%），传代条件为培养液颜色变浅或细胞贴至瓶底70%～100%。

1.5 细胞增殖抑制率检测 将胃癌AGS细胞按6×104/mL的密度接种在96孔板内，每孔放置100 μL细胞悬液，待其贴壁后，分别给予浓度为0 μg/mL（空白组）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹参素溶液及浓度为5 μg/mL的顺铂注射液溶液（阳性组）各100 μL，另取5个副孔只加入100 μL培养基，设为空白对照组，放于恒温箱24、48 h后，加入110 μL的CCK-8工作混合液，放于恒温箱孵育30 min，在酶标仪上测出450 nm处光密度（opticaL density，OD）值后，计算其抑制率。抑制率=[OD（Ac）-OD（As）]/[OD（Ac）-OD（Ab）]×100。As（含药组，含有药物、细胞、CCK8溶液、培养基），Ab（空白对照组，含有培养基、CCK8溶液，不含药物及细胞），Ac（空白组，含有细胞、培养基、CCK8溶液，不含药物）。实验重复3次。

1.6 细胞周期检测 将胃癌AGS细胞按2×105/mL的密度接种在6孔板内，每孔放置2 mL细胞悬液，待其贴壁后，分别给予浓度为0 μg/mL（空白组）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹参素溶液各2 mL，干预胃癌AGS细胞24 h、48 h后，胰酶消化、离心、PBS重悬、最后使用预冷的无水乙醇固定细胞。在检测时离心细胞，弃去含有无水乙醇的上清液，加入2 mL的PBS静置15 min后离心，吸出上清液并丢弃，加入1 mL DNA staining solution后放于暗处避光30 min后上机检测细胞周期。实验重复3次。

1.7 细胞凋亡检测 将胃癌AGS细胞按2×105/mL的密度接种在6孔板内，每孔放置2 mL细胞悬液，待其贴壁后，分别给予浓度为0 μg/mL（空白组）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹参素溶液各2 mL，干预胃癌AGS细胞24 h、48 h后，分别进行以下步骤操作：胰酶消化、离心、弃上清液、加预冷PBS后离心、弃上清液、加200 μL Bing Buffer重悬细胞、吸取一半重悬细胞放于流式管中、加入5 μL AV和10 μL PI、避光15 min、加入400 μL Bing Buffer后上机检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.8 Western blotting检测蛋白表达情况 将胃癌AGS细胞按4×105/mL的密度接种在6孔板内，每孔放置2 mL细胞悬液，待其贴壁后，分别给予浓度为0 μg/mL（空白组）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹参素溶液及浓度为5 μg/mL的顺铂注射液（阳性组）各2 mL干预胃癌AGS细胞，放于恒温箱培养24 h后对细胞进行收集，于冰上对细胞进行裂解，裂解完成后在低温离心机上进行离心，待结束后对蛋白进行提取并对所得蛋白定量分析，煮沸并收集变性蛋白，计算上样量。然后按照配胶、上样、电泳、转PVDF膜这一顺序收集转膜成功的PVDF膜，将膜放于牛奶中封闭，于2h后用TBST每隔10 min对其进行清洗，共计3次，加入稀释500倍的一抗后放于4 ℃冰箱过夜，第2天依法洗膜3次放于稀释5 000倍的二抗中，1 h后依法洗膜3次，最后加入ECL发光液行显影分析。

1.9 统计学方法 从Excel数据表中导入数据信息，用SPSS 25.0软件统计分析，计量数据使用“均数±标准差”表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 丹参素对胃癌AGS细胞增殖抑制率的影响 除空白组外，丹参素同一浓度不同时间段对胃癌AGS细胞均具有抑制作用，其抑制率随着药物的作用时间延长而逐渐升高（P<0.05），说明丹参素对胃癌AGS细胞的抑制具有时间依赖关系；与空白组比较，低、中、高浓度组的丹参素干预胃癌AGS细胞24 h，可使胃癌AGS细胞抑制率从8.10%上升到24.21%，干预胃癌AGS细胞48h，可使胃癌AGS细胞抑制率从15.24%上升到47.45%（P<0.05），说明丹参素对胃癌AGS细胞的抑制具有浓度依赖关系。阳性组对胃癌AGS细胞的抑制率明显高于高浓度组（P<0.05)。结果表明丹参素干预胃癌AGS细胞24、48 h，能呈剂量和时间依赖性地抑制胃癌AGS细胞的生长。而阳性组对胃癌AGS的抑制率优于丹参素。（见表1）

表1 丹参素对胃癌AGS 细胞增殖抑制率的影响 （x±s,%）

2.2 丹参素对胃癌AGS细胞凋亡的影响 丹参素干预胃癌AGS细胞24 h凋亡率如图1所示，与空白组比较，低、中、高浓度组丹参素干预胃癌AGS细胞后凋亡率分别为6.4%、12.2%、23.8%；干预胃癌AGS细胞48 h凋亡率如图2所示，与空白组比较，低、中、高浓度组丹参素干预胃癌AGS细胞后凋亡率分别为12.7%、21.1%、52.5%。结果表明，丹参素对胃癌AGS细胞有促凋亡作用，其凋亡率随着丹参素浓度的增加而升高（P<0.05）。

图1 丹参素对胃癌AGS 细胞凋亡的影响（24 h）

图2 丹参素对胃癌AGS 细胞凋亡的影响（48 h）

2.3 丹参素对胃癌AGS细胞周期的影响 丹参素干预胃癌AGS细胞24 h，对其周期影响如图3所示，与空白组比较，低、中、高浓度组的丹参素对胃癌AGS细胞G2/M期具有抑制作用，能够使G2/M期细胞数目显著增加，其抑制率从27.14%上升到50.26%（P<0.05）。丹参素干预胃癌AGS细胞48 h，对其周期影响如图4所示，与空白组比较，低、中、高浓度组的丹参素对胃癌AGS细胞G2/M期具有抑制作用，能够显著抑制G2/M期的细胞数，其抑制效果从40.94%上升到73.55%（P<0.05）。结果表明，丹参素干预胃癌AGS细胞后能将其周期阻滞于G2/M期。

图3 丹参素对胃癌AGS 细胞周期的影响（24 h）

图4 丹参素对胃癌AGS 细胞周期的影响（48 h）

2.4 丹参素对胃癌AGS细胞不同蛋白表达的影响 丹参素干预胃癌AGS细胞后对不同蛋白表达的影响如图5所示，与空白组比较，低、中、高浓度组丹参素及阳性组对胃癌AGS细胞Bax、p53、Cytochrome C蛋白的表达具有促进作用（P<0.05），对Bcl-2蛋白的表达具有抑制作用（P<0.05）。与丹参素高浓度组比较，阳性组Bax、Cytochrome C、p53蛋白表达升高明显，Bcl-2蛋白表达降低明显（P<0.05）。结果表明丹参素能够抑制胃癌AGS细胞Bcl-2蛋白的表达，促进Bax、p53、Cytochrome C蛋白的表达，并呈剂量依赖关系。阳性组对胃癌AGS细胞Bcl-2蛋白的抑制效果及对p53、Cytochrome C、Bax蛋白的促进效果较丹参素好。

图5 丹参素对胃癌AGS 细胞不同蛋白表达的影响

3 讨 论

近年来，由于中药抗癌取得了良好的效果，丹参及其有效成分被发现对胃癌具有较好抑制的效果，但大多是对其脂溶性成分的研究，对其水溶性成分的研究较少[5]。由于丹参素是丹参的水溶性成分之一，因此本实验采用丹参素作为实验药物。研究表明丹参素可以通过调控细胞内的信号因子，来抑制癌细胞生长并对癌细胞的凋亡起着积极作用[6-8]。本实验通过CCK8试剂检测证实丹参素可以对胃癌AGS细胞的增殖产生抑制作用，表明丹参素可以抑制胃癌细胞的生长，进一步验证了丹参素具有抗肿瘤作用。

细胞凋亡具有独特的生化和遗传途径，是细胞受到体内多种信号分子影响所发生的一种程序性细胞死亡，在正常组织的发育和体内平衡中起关键作用[9-10]。细胞凋亡受阻可以导致肿瘤发生，调控信号分子可以使细胞凋亡。细胞周期是按照一定顺序在细胞内不断发生的一组事件，细胞能够正常进行生长与分裂是因为细胞能够严格按照G0/G1→S→G2→M这一顺序进行[11-12]。如果细胞周期被阻滞于某一阶段，则会导致细胞增殖分化异常，最终凋亡，这表明周期阻滞是药物发挥抗癌作用的机制之一[13]。杨华等[4]发现丹参素可以通过周期阻滞来促进胃癌细胞凋亡；毕明慧等[14]使用丹参素作用于肝癌细胞后，发现p53高表达对肝癌细胞凋亡起着积极作用；贾金靖等[15]发现丹参素可以通过调控凋亡相关蛋白来控制银屑样细胞凋亡；彭汝琴等[16]通过实验证实丹参素能通过调控Bax、Bcl-2等凋亡蛋白来加速肝星状细胞凋亡。这提示丹参素可以通过多种途径来促进癌细胞的凋亡。在本实验中，将丹参素作用于胃癌AGS细胞后，随着时间的延长和药物浓度的增加，细胞凋亡率增加，G2/M期细胞比例上升，由此推断丹参素能够通过G2/M期阻滞来抑制胃癌AGS细胞生长，诱导细胞凋亡。

Bax、BCL-2蛋白与线粒体凋亡有着密切关联，在促进或抑制线粒体功能障碍引发的内在凋亡途径中起关键作用[17]。研究发现Bax/Bcl-2比值发生变化会使膜电位的稳态受到影响，使线粒体膜电位发生改变，导致与线粒体凋亡密切相关的Cytochrome C从线粒体释放到细胞质与Apaf1结合发生寡聚化，引起Caspase的级联反应，使凋亡程序开始进行，从而引起细胞凋亡的发生[18-23]。有研究[24-25]发现，DNA的损伤会活化p53。这时p53能够作为一个上游基因，调控Bax、Bcl-2蛋白表达来强化线粒体凋亡途径。这表明线粒体凋亡途径有Bax、Bcl-2、Cytochrome C、p53蛋白参与。在本实验中，将丹参素作用于胃癌AGS细胞后，p53、Bax、Cytochrome C蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达下降，这表明丹参素促进胃癌AGS细胞凋亡可以通过启动线粒体凋亡进行。

综上所述，丹参素能够抑制胃癌AGS细胞的生长，促进胃癌AGS细胞凋亡，其机制与丹参素阻滞细胞于G2/M期、启动线粒体凋亡有关。