基于Notch1通路探讨苍术酮对肝癌细胞化疗耐药的作用机制研究*

唐 凌，陈 莉，张 聪

（1.乐山市中医医院，四川 乐山 614000；2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 614000）

原发性肝癌是全球第六大常见癌症，也是全球癌症死亡的第二大常见原因[1]。手术治疗是早期肝癌的有效治疗手段，但大部分患者确诊时已是中晚期，故化疗一直是肝癌首选的临床治疗方法。然而化疗药物的组织特异性差[2]，若发生肝癌细胞耐药则会限制其治疗效果，并导致转移且预后不良[3]。因此积极探索肝癌化疗耐药的分子机制以寻找更有效的治疗靶点，对改善肝癌预后具有重要意义。Notch信号通路是一种高度保守的细胞信号系统，在调节细胞间接触、细胞存活、细胞增殖、细胞分化及多种生理过程中发挥着至关重要的作用。Notch1通路已被证明是多种癌症中的关键调节因子[4-5]，提示该通路可能与肝癌细胞化疗耐药进展相关。苍术酮是一种从中药苍术、白术中分离出的倍半萜类化合物，具有多种药理活性[6]。研究[7]发现其可通过降低线粒体膜电位，增加细胞内活性氧水平，诱导肝癌细胞凋亡，但关于其是否可介导Notch1通路调节肝癌细胞的化疗敏感性尚待探究。故本研究拟体外培养人肝癌耐药细胞株Bel/Fu，使用苍术酮干预，观察细胞存活、凋亡、侵袭情况，并检测细胞内相关因子表达水平，以期为肝癌化疗耐药干预靶点及药物选择提供一定的参考。

1 材 料

1.1 细胞系 人肝癌氟尿嘧啶耐药细胞株Bel/Fu购自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 试剂 苍术酮（纯度≥98%）（批号：PCS1052）购自成都植标化纯生物技术有限公司；5-氟尿嘧啶（批号：2352C062）购自上海艾研生物科技有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（批号：C1062L）购自上海碧云天生物技术有限公司；Matrigel基质胶（批号：356234）购自上海硕嘉生物科技有限公司；Invitrogen TRIzol试剂（批号：1382737）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；BCA试剂盒（批号：20190325）购自江苏凯基生物技术股份有限公司；ECL发光液（批号：70120200）购自biosharp生物科技公司；P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）（批号：6970-100）、多药耐药相关蛋白1（multiple resistance protein-1，MRP1）（批号：CAU32198）均购自武汉艾美捷科技有限公司；Notch1抗体（批号：ab167441）、Hes1抗体（批号：ab71559）、Jagged1抗体（批号：ab7771）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2）抗体（批号：ab182858）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（批号：ab32503）抗体均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 Gentier 96E实时荧光定量PCR系统（西安天隆科技有限公司）；MultiskanTMFC多功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；Gel Doc XR+凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 细胞培养 RPMI 1640完全培养液（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素）复苏细胞，置于37 ℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度环境条件下的培养箱中培养，每2d换液1次，细胞密度增至85%以上时进行传代，传代2～3次。

2.2 CCK8法检测不同浓度苍术酮对Bel/Fu细胞的增殖抑制作用 取对数生长期细胞，胰酶消化并离心，收集细胞沉淀，并分为对照组、4 μmol/L苍术酮组、8 μmol/L苍术酮组、16 μmol/L苍术酮组、32 μmol/L苍术酮组、64 μmol/L苍术酮组。其中对照组培养液为RPMI 1640完全培养液，各浓度苍术酮组培养液分别为RPMI 1640完全培养液+（4、8、16、32、64 μmol/L）苍术酮。利用对应培养液重悬细胞并接种100μL至96孔板（1×104个/孔），每个浓度各5个复孔，连续培养48 h。后于各孔内直接加入10 μL CCK8试剂，孵育2 h后利用全自动酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD）值，细胞存活率（%）=苍术酮作用组OD值/对照组OD值×100%。重复3次。

2.3 细胞分组与培养 取对数生长期的Bel/Fu细胞，胰酶消化并离心，收集细胞沉淀，分为空白组、5-氟尿嘧啶组、苍术酮组及联合组，其中空白组培养液为RPMI 1640完全培养液，5-氟尿嘧啶组、苍术酮组及联合组细胞培养液中分别添加5-氟尿嘧啶（20 μmol/L）、苍术酮（32 μmol/L）、5-氟尿嘧啶（20 μmol/L）+苍术酮（32 μmol/L）。

2.4 CCK8法检测各组细胞存活率 利用对应培养液重悬细胞并接种100 μL至96孔板（1×104个/孔），每个浓度各5个复孔，连续培养48 h。后于各孔内直接加入10 μL CCK8试剂，孵育2 h后利用全自动酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD）值，细胞存活率（%）=实验组OD值/空白组OD值×100%。此处实验组分别为5-氟尿嘧啶组、苍术酮组及联合组。重复3次，镜下观察并拍照记录各组细胞形态。

2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 对应培养液培养48 h后，收集细胞，PBS洗涤2次后1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀，70%乙醇4 ℃固定过夜。离心收集细胞，预冷PBS洗涤2次，结合缓冲液重悬，Annexin V-FITC溶液和PI溶液避光孵育20 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。重复3次。

2.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力 事先涂布Matrigel基质胶于Transwell 24孔板上室，并于每孔接种2×104个细胞，下室加入500 μL各组对应培养液（去除胎牛血清），48 h后，100%甲醇固定Transwell下侧侵入细胞20 min，0.1%结晶紫染色30 min，镜下观察并拍照、计数。重复3次。

2.7 RT-qPCR技术检测P-gp mRNA、MRP1 mRNA相对表达量 各组对应培养液培养48 h后，Trizol法提取各组细胞总RNA，检测RNA完整性及纯度，合格后将其反转录为cDNA，并于实时荧光定量PCR仪内进行定量检测，反应条件为94 ℃30s，60℃30 s，72 ℃1 min，30个循环，72 ℃10 min。以β-actin为内参基因，2-ΔΔCt法计算靶基因的相对表达量。引物序列：P -gp：F:5' -TGATTGCATTTGGAGGACAA -3'，R：5' -CCAGAAGGCCAGAG CATAAG-3'；MRP1：F：5'-AGGTGGACCTGTTTCGTGAC-3'，R：5'-CCTGTGATCCACCAGAAGGT-3'；βactin：F：5'-CATGGAGTCCTGTGGCATC-3'，R：5'-CAGGGCAG TGATCTCCTTCT-3'。重复3次。

2.8 Western blotting法检测通路、凋亡及化疗耐药相关蛋白相对表达情况 各组对应培养液培养48 h后，预冷RIPA裂解缓冲液提取各组细胞全蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加热变性蛋白，SDS-PAGE电泳凝胶分离蛋白，并湿转至PVDF膜上，1×TBST洗膜3次，后于5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗（1∶1 000稀释）内4 ℃孵育过夜；次日，1×TBST洗膜3次，二抗（1∶10 000稀释）内室温孵育2 h，1×TBST洗膜3次，ECL发光液显色，凝胶成像分析系统曝光，Image J分析条带灰度值，以目的蛋白P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、Bax与内参β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。重复3次。

2.9 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行数据统计学处理，计量资料均以“均数±标准差”（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3结 果

3.1 不同浓度苍术酮处理下各组细胞存活率比较 细胞存活率随苍术酮浓度增大而降低（P<0.05）。当苍术酮作用浓度为32 μmol/L时，细胞存活率接近50%。故选择32 μmol/L苍术酮进行后续实验。（见图1）

图1 不同浓度苍术酮处理下各组细胞存活率比较（±s，n=3）

3.2 各组细胞形态学观察 培养48 h后，镜下可见空白组细胞密度较大，呈梭形或卵圆形，排列规则，结构完整；5-氟尿嘧啶组细胞大部分呈长梭，结构完整，仅见少量死亡细胞；苍术酮组细胞密度小，细胞变大、形状不一，呈扁平贴壁状；联合组细胞凋亡严重，见大量细胞空泡化、坏死，核浓缩或崩解。（见图2）

图2 光镜下各组细胞形态图（×100）

3.3 各组细胞存活率比较 5-氟尿嘧啶组细胞存活率与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，苍术酮组及联合组细胞存活率明显降低（P<0.05）；与苍术酮组比较，联合组细胞存活率明显降低（P<0.05）。（见表2）

表2 各组细胞存活率比较 （±s）

表2 各组细胞存活率比较 （±s）

注：与空白组比较，aP<0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP<0.05；与苍术酮组比较，cP<0.05

组别 n 细胞存活率（%）空白组 3 100.00±0.00 5-氟尿嘧啶组 3 97.70±1.97苍术酮组 3 53.57±3.02a b联合组 3 42.73±2.63a b c F 528.539 P 0.000

3.4 各组细胞凋亡率比较 5-氟尿嘧啶组细胞凋亡率与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，苍术酮组及联合组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与苍术酮组比较，联合组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。（见图3、表3）

图3 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

表3 各组细胞凋亡率比较 （±s）

表3 各组细胞凋亡率比较 （±s）

注：与空白组比较，aP<0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP<0.05；与苍术酮组比较，cP<0.05

组别 n 细胞凋亡率（%）空白组 3 2.19±0.25 5-氟尿嘧啶组 3 2.81±0.33苍术酮组 3 25.40±1.94a b联合组 3 37.75±2.13a b c F 435.231 P 0.000

3.5 各组细胞侵袭情况比较 5-氟尿嘧啶组细胞侵袭数量与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，苍术酮组及联合组细胞侵袭数明显降低（P<0.05）；与苍术酮组比较，联合组细胞侵袭数明显降低（P<0.05）。（见图4、表4）

图4 各组细胞侵袭情况（×400）

表4 各组细胞侵袭数量比较 （±s）

表4 各组细胞侵袭数量比较 （±s）

注：与空白组比较，aP<0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP<0.05；与苍术酮组比较，cP<0.05

组别 n 细胞侵袭数（个）空白组 3 201.33±15.82 5-氟尿嘧啶组 3 189.67±11.02苍术酮组 3 101.33±12.90a b联合组 3 61.33±11.02a b c F 84.315 P 0.000

3.6 各组Bel/Fu细胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相对表达量比较 5-氟尿嘧啶组细胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相对表达量与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，苍术酮组及联合组细胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相对表达量明显降低（P<0.05）；与苍术酮组比较，联合组细胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相对表达量明显降低（P<0.05）。（见表5）

表5 各组细胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA 相对表达量比较（±s）

表5 各组细胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA 相对表达量比较（±s）

注：与空白组比较，aP<0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP<0.05；与苍术酮组比较，cP<0.05

组别 n P-gp mRNA MRP1 mRNA空白组 3 1.00±0.02 1.00±0.01 5-氟尿嘧啶组 3 0.95±0.03 0.97±0.03苍术酮组 3 0.71±0.04a b 0.67±0.06a b联合组 3 0.37±0.03a b c 0.42±0.05a b c F 261.342 126.930 P 0.000 0.000

3.7 各组细胞Notch1通路、凋亡及化疗耐药相关蛋白相对表达量比较 5-氟尿嘧啶组细胞中P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，苍术酮组及联合组细胞P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2蛋白相对表达量均明显降低，Bax蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）；与苍术酮组比较，联合组细胞P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2蛋白相对表达量明显降低，Bax蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）。（见图5、表6）

表6 各组细胞相关蛋白相对表达量比较 （±s，n=3）

表6 各组细胞相关蛋白相对表达量比较 （±s，n=3）

注：与空白组比较，aP<0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP<0.05；与苍术酮组比较，cP<0.05

组别 P-gp MRP1 Notch1 Hes1 Jagged1 Bcl-2 Bax空白组 0.67±0.05 0.71±0.07 0.24±0.03 0.38±0.04 0.63±0.07 0.43±0.05 0.23±0.02 5-氟尿嘧啶组 0.58±0.06 0.63±0.06 0.21±0.04 0.35±0.05 0.59±0.06 0.41±0.04 0.22±0.03苍术酮组 0.29±0.04a b 0.20±0.03a b 0.15±0.02a b 0.26±0.02a b 0.28±0.03a b 0.24±0.01a b 0.34±0.02a b联合组 0.08±0.01a b c 0.12±0.01a b c 0.10±0.01a b c 0.14±0.02a b c 0.17±0.01a b c 0.18±0.01a b c 0.64±0.04a b c F 112.667 112.211 15.600 28.469 65.295 42.884 139.727 P 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000

图5 各组细胞相关蛋白表达Western blotting 图

4 讨 论

5-氟尿嘧啶是一种抗癌药物，被用作肝癌治疗的标准化疗药物之一。其在高浓度下可获得耐药性和细胞毒性，致使其治疗效果较弱[8]，故研究肝癌细胞耐药性机制和治疗策略以逆转耐药性和使癌细胞对5-氟尿嘧啶再敏感至关重要。中医药治疗肿瘤疗效确切，可抑制肿瘤生长、提高患者生存质量、减轻临床症状。据报道，中西医联合治疗可减少西药毒副作用、降低术后复发率、延缓病情进展，对防治肿瘤作用显著[9-10]。苍术酮为临床常用抗肿瘤中药白术的主要成分之一。研究发现，苍术酮具有一定的体内抗肿瘤效应[11]，可抑制肝癌细胞HepG2活力和迁移，影响细胞正常形态结构、生长并促进细胞凋亡[7,12]。本研究采用体外培养人肝癌氟尿嘧啶耐药细胞株Bel/Fu，并利用苍术酮干预。结果显示：细胞存活率呈剂量依赖性降低，提示苍术酮可抑制肝癌细胞化疗耐药株细胞增殖；另经联合应用后，与5-氟脲嘧啶组比较，联合组细胞存活率、侵袭数量显著降低，细胞凋亡率显著升高，且镜下细胞形态变形，结构可见有损伤，说明苍术酮可增强5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。

多药耐药是肿瘤化疗失败的最常见原因，耐药性与ATP结合盒蛋白家族药物转运蛋白的过表达有关，包括多药耐药性1基因及其编码产物P-gp、MRP等[13]。P-gp是一种跨膜蛋白，可将药物排出体外，降低药物在细胞内的生物利用度，从而降低药物抗癌的功效。P-gp可保护耐药细胞免受自由基、辐射和细胞毒药物诱导的各种形式的半胱天冬酶依赖性细胞凋亡的影响，延缓细胞凋亡级联反应，在分子水平上建立肿瘤抗性和细胞凋亡耐受性之间的有机联系[14]。MRP1也称为ABCC1，为ATP结合盒转运蛋白超家族的成员。其表达下调可逆转化疗耐压癌细胞的耐药性[15]，MRP1MRP1/ABCC1的过表达预示着SCLC对化疗的不良反应[16]。SUN Z等[17]研究表明，P-gp可促进耐多药肝癌HepG2/ADM细胞系多药耐药发展。ZHOU Y等[18]研究发现，多重耐药人肝癌细胞株SK-Hep1/顺铂中P-gp、MRP1蛋白相对表达量显著高于SK-Hep1。LI S等[19]研究显示，P-gp和MRP1的表达抑制可增加由丙型肝炎病毒感染的人类肝癌Huh7.5.1细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。本研究结果显示，与5-氟尿嘧啶组比较，苍术酮单独作用、苍术酮联合5-氟尿嘧啶作用Bel/Fu细胞后，细胞中P-gp、MRP1的mRNA和蛋白相对表达量均降低，且联合应用后效果更显著，提示苍术酮可通过抑制耐药相关蛋白表达提高药物在细胞内的生物利用度及细胞凋亡级联反应，进而增强肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。

肝癌细胞耐药机制复杂，包括识别和泵出肿瘤细胞抗癌药物的药物外排转运蛋白表达增加、药物在细胞内积聚的重新分布、细胞凋亡信号通路的失活等[20]。到目前为止，HCC耐药性的确切机制仍有待研究。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2家族的两种代表性蛋白，Bax和Bcl-2在正常细胞中形成二聚体且表达相对稳定。当Bax表达增加而Bcl-2表达减少时，两者之间平衡被打破，可诱导细胞凋亡[21]。Notch1通路是一种细胞-细胞间的通信机制，由细胞膜结合的Notch受体与其配体（如Jagged1～2）在并列细胞上相互作用而激活。质膜上释放Notch胞内结构域进入细胞核，与CSL转录因子及共激活因子形成复合体可促进Notch靶基因如Hes、Hey的转录，在调节增殖、凋亡/生存中发挥重要作用[22]。ZHOU J等[23]研究发现，抑制Notch1/Hes1信号通路可增强人胃癌细胞皮下异种移植模型对5-氟尿嘧啶的化学敏感性，此时Bax表达上调，Bcl-2表达下调，细胞凋亡增加。LI N N等[24]研究表明，转染Notch1 siRNA可下调MRP1表达和活性。另有研究显示，Notch1敲低可导致P-gp和MRP1表达水平降低，抑制人肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭，并增加其体外对5-氟尿嘧啶的敏感性[25]。本研究结果显示，苍术酮单独作用Bel/Fu时，可显著降低Notch1、Hes1、Jagged1及Bcl-2蛋白相对表达量并上调Bax蛋白相对表达量，且5-氟尿嘧啶联合苍术酮后，细胞内Notch1、Hes1、Jagged1及Bcl-2蛋白相对蛋白相对表达量量下调或Bax表达上调更为显著，提示苍术酮可能通过抑制Notch1通路激活降低耐药相关蛋白P-gp和MRP1及抗凋亡蛋白Bcl-2表达，提高促凋亡蛋白Bax表达，进而增强肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。

综上所述，苍术酮可提高细胞凋亡率，降低细胞存活及侵袭能力，增强肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性，其作用机制可能与抑制Notch1通路激活有关。