冷应激对动物血清生化指标、抗氧化能力及免疫功能影响的研究进展

苑景达 额日格力图 任晓琪 何小龙,2*

(1.内蒙古民族大学动物科技学院,通辽 028000;2.内蒙古自治区农牧业科学院,呼和浩特 010031)

应激是指机体对外界和内部的各种刺激所产生的非特异性反应的总和。在生产过程中,存在着诸多应激因素,如冷、热、运输和惊吓等,这些刺激都会对动物机体造成危害。我国北方地区冷季较长,低温和高风速的影响使动物长期处于冷应激状态,给动物机体带来严重损伤,甚至导致动物死亡。根据持续时间和刺激程度的不同,冷应激可分为2类,即急性冷应激和慢性冷应激,但因为不同个体的体型大小、被毛长短、生理年龄和种系的不同,其冷应激的阈值也有所不同,一般情况下低于常温10～15 ℃,持续时间2～24 h为急性冷应激,而低于常温5～20 ℃,持续时间3～21 d称为慢性冷应激[1]。持续暴露在低温环境中会破坏动物的生理平衡,导致免疫机能下降[2]。虽然近些年来畜牧业生产水平在不断提高,集约化生产模式也在逐年增多,但由于地区发展不平衡、动物习性、动物福利和生产需要等因素仍需为动物保留一定的活动空间和通风措施,所以在生产中很难实现全封闭饲养[3-4]。当动物处在冷应激状态下,低温环境对抗氧化能力和免疫功能的影响直接导致了动物机体组织器官受损,给畜牧业带来了较为严重的经济损失。因此,本文就冷应激对动物血清生化指标、抗氧化能力和免疫功能的影响作一综述,为指导冷季畜牧生产提供参考。

1 冷应激对动物血清生化指标的影响

血清生化指标可以在动物遭受冷应激时反映出机体器官、组织所发生的整体或者局部的代谢变化。通过血清中生化指标的变化规律研究冷应激,可以较为直观准确地反映出动物所处环境对动物机体所产生的刺激程度,有利于探明冷应激时动物的适应机制,从而减少冷应激为畜牧生产工作所带来的负面影响。

1.1 冷应激对动物血清酶的影响

血清中的酶不但参与机体的免疫和抗氧化,还参与动物机体的生长发育。谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)都可以直接反映出动物所处环境是否舒适、肝脏机能是否受到损伤[5]。其中AST和ALT是重要的转氨酶,它存在于动物的线粒体当中,对蛋白质代谢起着重要的作用,其活性的变化可以直接反映动物肝脏的健康状态[6-7]。ALT和AST正常情况下存在于肝脏组织,不会通过细胞膜逸出,在受到应激导致肝脏受损时,细胞膜通透性增大,ALT、AST随之大量进入血清,因此,在临床医学上常用血清中ALT、AST活性作为判断肝脏是否受到损伤的重要指标。Zhang等[8]研究发现,雄性雏鸡暴露于慢性冷应激时血清AST和ALT活性显著增加,组织学观察发现肝小叶受损、肝细胞变性且细胞质出现空泡化。这与Zhou等[9]的研究结果一致,说明随着冷应激时间的延长,低温对动物的肝细胞代谢产生了影响,冷应激对肝脏功能造成了损伤。但全鑫等[10]发现,小鼠在慢性冷应激状态下血清AST活性显著下降,ALT活性没有显著变化,但在组织观察中也发现了肝脏较多的空泡样病变和肝细胞变性,这可能是由于冷应激影响了酶的活性且冷应激的强度较弱还没有影响到肝脏的代偿能力。综上所述,冷应激会对动物的肝脏造成损伤且影响其肝细胞代谢,但可能由于冷应激的强度、持续时间和不同品种的耐寒性能不同,使血清中AST和ALT活性的变化规律有所不同,其机理有待于进一步的探究。肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)主要存在于骨骼肌和心肌细胞中,其主要作用是为肌肉收缩和运动系统供能[11]。当组织受到损伤或疲劳时,CK和LDH会由于细胞膜的破损进入血液,所以其在血液中活性的增加可以用来判断动物组织受到了损伤。白丹丹等[12]研究发现,三河牛在受到慢性冷应激时血清中CK活性均显著高于非应激期;Xue等[13]也发现,当大鼠暴露于急性冷应激的环境中,血清中LDH和CK活性迅速升高。这说明冷应激对CK活性影响较大,表明冷应激使动物骨骼肌和心肌细胞受到了一定程度的损伤。Correa等[14]在冬季使用罐式托车对育肥猪进行运输时发现,冬季时育肥猪血清CK活性显著高于夏季,这可能是因为运输疲劳和冷应激的综合作用下造成了肌肉组织的损伤,从而使血清CK活性上升。以上研究表明,当机体处于冷应激环境时导致了细胞代谢异常,引起了心肌、骨骼肌受损,从而血清CK活性有所升高;血清中LDH活性的升高则表明此时机体组织已经发生病变,机体的糖代谢过程已经转变为无氧酵解。

1.2 冷应激对动物血清蛋白质代谢的影响

血清总蛋白(total protein,TP)是血清固体成分中含量最多的一类物质,其含量的增高有助于提高机体的代谢、免疫水平,其含量的高低直接反映了动物的健康、营养情况[15]。血清白蛋白(albumin,ALB)在体内主要起着运输体内代谢物质的作用。研究发现,与冷季补饲的牦牛相比,不补饲的牦牛血浆TP和ALB含量呈下降趋势,这不仅表明冷季放牧影响了牦牛的蛋白质摄入量,还表明寒冷环境加强了牦牛体内的蛋白质代谢过程[16]。Wichman等[17]研究表明,相比出生于较为温暖季节(9月)的犊牛,出生在寒冷季节(1月)的犊牛血清ALB含量显著降低,且寒冷季节出生的犊牛成功站起所需的时间相较温暖季节出生的犊牛更长。Gao等[18]研究也发现,在冬季遭受冷应激的驴其血清TP含量明显低于有防风措施的驴。综上所述,低温降低了动物机体代谢水平和免疫功能,冷应激时动物血清中ALB和TP含量的下降表明其对低温的适应能力较差,蛋白质的合成和分解已经失衡。需要注意的是,在对放牧动物进行冷应激研究时,冬季血清TP和ALB含量的降低还可能是由于冬季放牧时牧草营养价值低导致蛋白质摄入量较少造成的,因为血清TP含量与营养因素也存在着密切相关。尿素氮(urea nitrogen,UN)是动物蛋白质代谢的重要指标,其在反刍动物氮素循环中发挥着重要的作用,血清中UN含量的升高表明体内蛋白质过度分解[19]。冷应激下血清中UN含量上升表明肾脏受到了刺激使其排泄UN的功能下降,机体蛋白质代谢处于较差的状态[20]。白丹丹等[12]研究发现,三河牛在冷应激时血清UN含量相对与非应激期间有着显著提高。Liu等[21]研究发现,在冷应激时未饲喂过抗应激添加剂的肉鸡血清UN含量明显高于饲喂过抗应激添加剂的肉鸡。综上所述,冷应激时动物血清UN含量呈上升趋势,表明蛋白质和氨基酸的分解增强,此时动物肾脏的代谢功能下降;此外,反刍动物血清UN含量的升高也可能是因为在天气寒冷时由于新鲜牧草匮乏和饲草营养价值较低等原因,通过增加氮沉积来弥补蛋白质摄入的不足所导致。

1.3 冷应激对动物血清激素分泌的影响

动物受到冷应激时机体通过产热来维持体温恒定,此时内分泌系统发挥着重要的作用,机体通过交感-肾上腺髓质(sympathetico-adrenomedullary,SAM)轴、下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴、下丘脑-垂体-甲状腺(hypothalamic-pituitary-thyroid,HPT)轴和一些相关激素共同在冷应激时发挥作用。冷应激可以迅速提高促甲状腺激素(thyroid hormone,TSH)的分泌,使得血清三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)和甲状腺素(thyroxine,T4)含量迅速升高,T3可增强钠钾泵ATP酶的活性,有利于Na+、K+的跨膜转运,使红细胞内K+的含量发生变化,导致ATP消耗增强,最终使机体产热增加以维持恒定的体温[22]。研究发现,内蒙古三河牛在受到严重的冷应激后血清T3、T4含量均显著升高[23]。也有研究发现,长期暴露于寒冷环境下的家兔血清T3含量显著升高,但血清T4含量显著降低,这可能是因为长期暴露在寒冷条件下时T4增加了向T3的转化造成的[24]。陈浩等[25]研究发现,冷应激时蒙古牛血清中T3和T4的含量显著升高,但血清TSH含量没有显著变化,可能是由于T3和T4含量过高负反馈抑制了TSH的生成。以上研究表明,处于冷应激时会激活机体的HPT轴,此时TSH分泌增多导致T3、T4含量相较非冷应激期间会迅速上升,加快糖异生作用和肝糖原的合成,提高机体温度,从而提高自身对低温环境的适应能力。

当机体受到冷应激时体内的SAM轴被激活,刺激了肾上腺髓质使其释放肾上腺素和去甲肾上腺素以使机体适应寒冷环境,当SAM轴的调节不能使机体适应寒冷环境时,HPA轴开始发挥作用,此时下丘脑释放促肾上腺皮质激素释放激素,从而刺激垂体生成促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH),进而使糖皮质激素(glucocorticoid,GC)的分泌增多,对下丘脑和垂体进行负反馈作用的调节,但HPA轴的长期激活会使机体发生病理变化[26-27]。研究表明,在遭受冷应激时蒙古牛血清中ACTH和GC含量显著上升,说明冷应激状态下激活了HPA轴,机体通过这种方式增强了肝糖原的异生,从而为机体提供了能量,使动物在冷应激状态下维持了内环境的平衡[25]。肾上腺皮质分泌的皮质醇(cortisol,COR)作为盐皮质激素醛固酮的前体物质可以参与糖、脂肪和蛋白质的代谢,寒冷时会刺激COR的分泌,从而增强机体对低温的耐受能力[28]。Carnovale等[29]研究发现,延长冷应激时的运输时间时杜蒙杂交羊血清COR含量显著升高,血清ACTH含量也呈上升趋势,表明长时间的冷应激增强了环境对HPA轴的刺激,杜蒙杂交羊通过增强COR的分泌调节机体的糖代谢过程,促进糖原异生和升高血糖,最终达到保护机体的目的。Abbas等[19]研究也发现,与对照组相比,冷应激时奶牛血清COR含量显著升高,但血清ACTH含量显著下降,这可能是由于COR含量过高负反馈抑制了ACTH的生成。综上所述,动物在受到冷应激时,为了保护机体会激活机体的HPA轴和SAM轴,使机体ACTH和COR分泌增多来调节糖、脂肪和蛋白质的代谢,增强机体对冷应激的防御反应,从而维持机体的内环境稳态。

血清中的葡萄糖来自于动物在进食后对食物进行消化吸收后的糖原分解和糖异生作用。在冷应激环境下血液中葡萄糖含量会增加,以增强能量供应[30]。胰岛素(insulin,INS)作为动物体中重要的激素,可以降低血液中葡萄糖的含量,参与机体代谢,加速脂肪合成、储存。胰高血糖素(glucagon,GLU)是一种由胰腺α细胞分泌的强效升糖激素,其通过诱导肝脏生成葡萄糖从而升高血液中葡萄糖含量[31]。Wang等[32]研究发现,与秋季适宜温度相比,冬季发生冷应激时西门塔尔牛血液中INS含量显著升高。Wellington等[33]也发现,相比处在等热区的山羊,冷应激组的山羊血液中INS含量呈升高趋势,表明冷应激时血糖升高刺激了胰腺使其分泌INS,从而改善机体对葡萄糖的耐受性。Zhang等[34]研究发现,蒙古羊在冷应激时血清中葡萄糖和GLU含量显著升高。高静雯等[35]的研究也发现,在受到冷应激时阿勒泰羊血清中葡萄糖含量明显升高,但冷应激的时间和强度不同,血清中INS和GLU含量的变化规律有所不同。以上研究表明,动物受到冷应激后血清中葡萄糖含量会升高,此时糖原分解、糖异生作用增强,机体动用沉积的能量,分解体内脂肪等营养物质通过提高自身温度来对抗冷应激,但刺激强度、持续时间不同,血清中GLU和INS含量的变化规律也有所不同。

2 冷应激对动物抗氧化能力的影响

丙二醛(malondialdehyde,MDA)为脂质过氧化反应链式终止阶段的产物,其含量的多少反映了机体自由基的生成情况,脂质过氧化程度高时,细胞的细胞膜结构会遭到破坏,出现细胞内的核酸等物质受到损伤和机体代谢紊乱[36]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)是酶促系统中主要的抗氧化酶,其可以抵抗组织器官免受氧化损伤。GSH-Px可以保护细胞膜结构,阻止脂质过氧化物堆积时对生物膜和组织的损伤。SOD的主要作用也是保护细胞,但其主要是通过清除体内的超氧阴离子自由基发挥保护作用,因此它的活性直接反映了机体清除自由基的能力。总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)能够反映抗氧化酶系统对外界刺激的抵抗能力及动物体内的自由基是否平衡,其降低时机体更容易发生疾病[37]。冷应激时机体的氧化-抗氧化平衡被打破、自由基过剩,从而产生大量的脂质过氧化物,进而出现氧化应激的现象[38]。El-Gindy等[39]研究发现,与添加抗冷应激添加剂的雄兔相比,正常饲喂的雄兔受到冷应激时,血清SOD和GSH-Px活性显著降低,表明冷应激损伤了动物的抗氧化系统。刘春朋等[40]发现,鹌鹑在遭受急性冷应激时血清GSH-Px活性表现为波动状态,在遭受慢性冷应激时血清GSH-Px和SOD活性呈下降趋势,且MDA含量增加,并出现了法氏囊细胞凋亡,表明冷应激诱发了动物的氧化应激,氧化应激对动物的免疫机能造成了影响并伴随着免疫器官细胞凋亡。在低温环境下饲养的羔羊也出现血清SOD和T-AOC活性的降低和MDA含量升高,表明羔羊在低温时抗氧化能力有所下降[41]。但陈浩等[42]研究发现,相比于非应激期间,西门塔尔牛在冬季冷应激时血清中MDA含量显著升高,T-AOC也随着冷应激时间的延长表现为升高,这可能是因为常年生活在寒冷地区的西门塔尔牛适应了当地气候,使T-AOC代偿性升高。综上所述,冷应激状态下打破了抗氧化酶系统的平衡,机体由于处于应激状态下生成了过量的自由基,导致抗氧化酶GSH-Px、SOD活性下降和脂质过氧化产物MDA含量升高,但长期在寒冷环境下生活的动物其机体中的抗氧化酶会出现代偿性升高来帮助机体适应周围环境,减少了氧化应激对动物产生的损伤,其代偿性升高的机理有待于深入研究。

3 冷应激对动物免疫功能的影响

免疫系统对机体的正常运行起着极其重要的作用,机体免疫系统的调节较为复杂,且冷应激时间和强度不同以及动物品种不同都可能表现出不同的免疫反应。免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)主要在脾脏合成,在特异性免疫中发挥重要的作用。Shi等[41]研究发现,室外组与电加热室内组相比,羔羊血清IgA的含量显著降低。但Su等[43]研究发现,早期适当的冷应激时肉鸡血清免疫球蛋白含量反而显著升高,表明适当的冷应激使肉鸡的免疫水平有所提高。Li等[44]研究也发现,接受过间歇冷应激训练的鸡在冷应激时血清免疫球蛋白含量更为稳定。研究显示,迅速的强冷刺激对动物的免疫系统有抑制作用,而缓慢较弱的冷刺激可以提高免疫功能[45-46]。综上所述,冷应激对动物的体液免疫功能随着冷应激的类型而变化,虽在迅速强烈的冷应激时会使体液免疫机能受到抑制,但缓慢适当的冷应激或冷刺激反而对体液免疫功能有积极作用,可提高动物对低温环境的适应能力。有研究发现,白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)可以作为判断动物是否遭受冷应激的指标[47]。应激时体内少量分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-2、IL-4、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等促炎因子对机体有保护作用,而促炎因子分泌过多则会引起动物的组织器官损伤,对免疫系统造成破坏[48]。不同的促炎因子发挥的功能不同,例如,IL-2可以参与抗体反应,同时还可以增强T淋巴细胞活性;IL-4也在体液免疫中发挥着重要作用,其可以使B细胞成熟并刺激B细胞产生免疫球蛋白,从而发挥重要的免疫作用。彭孝坤等[49]研究发现,绵羊在遭受冷应激后血清IL-2和IL-6含量显著上升,IL-4含量显著下降。Zhao等[50]研究表明,相比于对照组,急性和慢性肉鸡肠道中的IL-2 mRNA表达量升高,IL-4 mRNA的表达量均呈现先升高后降低的趋势。Hu等[51]研究表明,与20 ℃时相比,大鼠在4和-20 ℃时血浆中IL-2和IL-4含量显著升高。综上所述,冷应激使动物机体进入免疫抑制状态,冷应激时代表细胞免疫水平的IL-2含量会出现升高,但关于冷应激时IL-4含量变化的研究结果尚不一致,这可能是由于不同的白细胞介素在冷应激时发挥的功能有所不同所致。

4 冷应激的防控措施

4.1 营养调控

寒冷状态下,动物主要通过采食量和代谢率的增加来维持体温,虽然寒冷状态下采食量有所上升,但对生产没有帮助,而且对其免疫系统、神经系统以及生长发育都会产生不良影响,给生产带来直接的经济损失。低温会导致维生素C的合成能力下降,从而影响机体代谢,所以在低温时补充一定的维生素C是必要的[52]。龚勋等[53]在研究添加不同剂量维生素C对幼龟冷应激缓解效果时发现,冷应激前与对照组相比,除添加500 mg/kg维生素C组外,其他组血清AST、ALP活性均升高,其中添加100 mg/kg维生素C组血清ALT活性显著升高,而冷应激后与对照组相比,只有添加2 500 mg/kg维生素C组血清中葡萄糖含量下降,说明添加适量的维生素C缓解了冷应激造成的幼龟肝脏损伤,而过低或过高剂量的维生素C反而对幼龟的生理代谢和抗应激有抑制作用。低温环境下,由于代谢率升高导致自由基的生成增多,破坏了机体氧化与抗氧化系统的平衡,最终导致氧化应激[54]。研究发现,维生素C能够在大鼠发生氧化应激时降低其血清中AST、ALT活性,改善氧化应激所引起的肝脏损伤,在氧化应激时对组织有保护作用[55]。研究表明,维生素E和硒可以有效缓解母牛的应激反应,维生素E通过结合自由基从而达到保护机体的作用[56]。氨基酸作为动物生长发育中重要的营养物质,其对细胞的生长和更新以及维持能量平衡都起着重要的作用。在动物发生冷应激时,氨基酸也能在抗氧化方面发挥重要的作用。研究发现,当补充1%的精氨酸时,育肥猪血清中T-AOC和GSH-Px活性增加[57]。黄思琪等[58]发现,在冷应激仔猪饲粮中添加0.8%的L-精氨酸对生长性能有显著的改善作用,添加1.2%的L-精氨酸时有效抑制了胸腺、脾脏的萎缩,并提高了血清中IgA、IgG、IgM含量。综上所述,在饲粮中添加抗应激添加剂可以有效改善动物冷应激时的血清生化指标,抑制免疫器官萎缩,增强动物对低温的耐受性,一定程度上缓解冷应激所导致的动物机体的损伤。

4.2 环境调控

温度对动物的健康生长起着至关重要的作用,在我国北方冬季严寒,必须通过环境调控才能减少冷应激给动物生产带来的经济损失。郭文亮等[59]发现,在内蒙古冬季时,与开放式羊舍相比,封闭式羊舍提高了羔羊的免疫水平,降低了羔羊的料重比,提高了日增重。张晓庆等[60]研究发现,冬春季使用暖棚饲养母羊时,由于温度的提高有效地减少了越冬时的体重损失,并提高了母羊的繁殖力,缓解了冷应激所带来的不适。Zhang等[61]研究发现,在寒冷环境下,提供水温在30 ℃、水流为300 mL/min流速的饮水时,仔猪的平均日增重显著提高,料重比显著降低,并降低了腹泻率,此外还伴随着优势盲肠微生物区系的改善,主要表现在变形菌门的丰度降低和拟杆菌门的丰度增加,说明寒冷天气下为仔猪提供温度适宜的饮水有利于维持健康的肠道微生物环境,减少寒冷所带来的刺激。王美芝等[62]研究发现,在使用地暖、保温灯供暖代替仔猪保温箱时,保温灯也可满足仔猪对于猪舍的温度需求,有效地提高了仔猪日增重且减少了仔猪的死亡率。Hu等[63]研究显示,在低温鸡舍中使用暖管系统,有效缓解了母鸡的冷应激,血浆中IL-6含量显著提升。以上研究表明,与营养调控相比,环境调控对于动物缓解冷应激有着成本低、操作方便的优点,能够有效缓解动物的冷应激,对免疫功能、生长性能和饲料利用率等方面都有改善作用。

5 小 结

尽管国内外对动物冷应激的研究有很多,但冷应激对不同动物血清生化指标的影响并不完全一致,这可能是由于动物种类、生理状态和所处环境的不同所导致;冷应激时动物抗氧化能力、免疫功能的改变也可直观反映动物组织或机体受损伤的程度。因此,应深入研究冷应激对动物血清生化指标、抗氧化能力和免疫功能的影响及其影响因素,解析冷应激时动物身体机能变化和适应机制,最终通过营养与环境等调控手段减小冷应激给畜牧业所带来的负面影响。