胎盘屏障体外模型的应用与研究进展

齐子棠，宋殿荣

（1.天津中医药大学研究生院，天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院妇科，天津 300250）

胎盘是整个妊娠期支持胎儿发育的重要器官，在母体和胎儿之间形成血-胎盘屏障（blood-placenta barrier，BPB），通过营养物质和气体的交换来滋养胚胎并保护胎儿免受有害物质的攻击［1］。BPB 具有可调节母体-胎儿双向物质交换的独特生理结构，是防止致病微生物与外来化合物进入胎儿血液循环系统的重要防线。但从20 世纪60 年代的沙利度胺（Thalidomide）海豹儿到近年感染寨卡病毒的母亲所生婴儿14%出现神经发育缺陷［2］这些导致严重后果的公共卫生事件来看，对BPB 系统的认知尚不够全面。由于物种之间存在形态功能的差异和伦理约束，无法通过动物或足月娩出胎盘完全复制出在不同妊娠时期BPB 结构的变化，对外源物所致胚胎发育毒性的认知也十分有限。有调查显示，97%孕妇在妊娠期间至少服用1种药物，但仅有1/3药物安全性得到验证，而持续摄入药物对子代影响的前瞻性临床研究也需更多证据阐明其相关潜在机制［3-4］。人BPB 体外模型的构建与应用研究将为妊娠期安全用药研究提供可靠的模型与理论支撑，从而进一步指导临床妊娠期相关疾病的治疗。本文将对BPB转运过程中蛋白与代谢酶的表达、模型主要构建方法及现阶段应用与发展前景进行综述。

1 BPB转运与代谢功能概述

胎盘动态地参与物质转运过程并允许一些外源化合物主动穿过BPB。合体滋养细胞层（syncytiotrophoblast，STB）与胎儿毛细血管中都存在参与物质转运的膜蛋白，这些转运蛋白在调控分子朝向或背离胎儿的过程中起关键作用［5］。位于母体面的顶端刷状缘P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer-related protein，BCRP）、多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated proteins 2，MRP-2）/MRP-3 和有机阳离子转运体（organic cation transporter，OCT）可将进入胎儿侧的化合物再重新运回母体，这不仅能阻止许多有害物质透过胎盘，也导致诸多药物成分透过率低。许多转运蛋白表达量随胎龄而变化，而BPB 的渗透性亦随之改变［6-7］。临床中，在选择妊娠期药物并进行安全性评估时，应综合考虑孕周对其潜在影响。

胎盘的代谢活性有限（低于肝和肾），Ⅰ相酶中的细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）深度参与胎盘代谢过程，其亚型包括CYP2（CYP2C，CYP2D6，CYP2E1 和CYP2F1），CYP3（CYP3A4，CYP3A5和CYP3A7）和CYP4B1，在妊娠早期的人胎盘中均可检测到其mRNA和蛋白表达。足月胎盘样本研究显示，尼古丁摄入会导致CYP19A1活性降低和CYP1A1 活性升高，而苯并[a]芘等有毒化学物质会被CYP1A1 诱导激活并与DNA 结合生成反应性毒性代谢物，提示在胚胎最易致畸的妊娠早期，外源物的代谢在胚胎发育和器官形成过程中至关重要［8］。此外，Ⅱ相酶中的谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases，GST）可以与亲电性分子结合减弱药物对胎儿宫内暴露的影响。研究表明，增强GST和尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶的代谢活性有助于降低三聚氰胺向胎儿侧的转运；而妊娠第8 至第9 周开始表达的GSTP-1 亚型若受到氟西汀的抑制会导致胚胎发育毒性［9-10］这种变化是胎盘屏障防御机制的重要组成部分之一。而酶活性作为胎盘毒性的生物标志物值得被进一步关注。

2 体外胎盘灌注模型

2.1 构建与评价

体外胎盘灌注模型又称胎盘小叶灌流模型［11］，由Panigel 提出，是具有保护胎盘组织和功能完整性的评价胎盘代谢和转运的经典模型之一。制作方法是在保留胎盘完整的情况下，通过结扎脐动静脉分支穿刺置管建立单叶胎儿侧循环；切除多余胎盘组织，将2 根灌注管插入胎盘母体一侧的间隙2～3 mm 建立母体循环；以胎儿侧灌注液损伤量＜2～4 mL·min-1作为标志，在母体侧以加入100%浓度小分子化合物安替比林2.5 h 后观察胎儿与母体侧血药浓度比（Feto-Maternal blood concentration ratio，F/M）＞0.75 作为标准［12］，记录蛋白质和离子的转移结果，进而准确检测外源性物质在胎盘内转运和相关药动学数据的变化，常被作为BPB 转运研究的阳性参照。

该模型因能具备胎盘完整结构而被广泛应用，但由于供体之间的差异化无法控制，导致模型标准化构建十分困难；尽管灌注足月胎盘可以较好维持组织结构，但药物与母体或胎儿血浆的结合等因素在灌注过程中不能模仿，尤其是妊娠所处时期不同导致胎盘结构有很多不同，故外源物透过率以及对胎儿影响也存在较大变化，使得该模型无法准确预测孕期各阶段药物转运水平。

2.2 应用

目前通过该模型检测了孕期使用的各类药物包括抗生素、抗癌、抗癫痫和降压药等从母体到胎儿侧的转运情况［13］。Broekhuizen等［14］使用该方法成功建立了健康和先兆子痫胎盘模型，分别检测己酮可可碱通过环磷酸腺苷、一氧化氮-环磷酸鸟苷-蛋白激酶G 途径和腺苷A1 受体拮抗引起的血管扩张效应以及抗炎作用，研究结果表明，腺苷A1 受体拮抗剂己酮可可碱可能成为先兆子痫治疗的新选择。Gruber 等［15］使用人类血浆蛋白包裹80 nm 聚苯乙烯纳米颗粒研究其在穿越BPB 时的动态变化，通过蛋白质组学分析分别测试人白蛋白和IgG 介导聚苯乙烯颗粒穿越胎盘屏障的能力，为下一步开展纳米药物的胎儿宫内治疗提供参考。近期研究人员结合数学计算改进模型，系统研究妊娠期通过OCT3介导和细胞旁扩散在人胎盘合体滋养层上实现二甲双胍双向传输的潜在机制［16］，为临床使用二甲双胍提供更精准的数据。而Lewis等［17］将房室模型与血流（血液流动、膜转运和代谢）模型相结合，建立了一个有效的预测生物学行为模型，以提供量化框架并合理预测妊娠过程中因药物使用过量导致胎盘功能损害进而影响胎儿生长的问题，为体外灌流模型结合先进技术进行下一步研究提出了新发展方向。

3 滋养层细胞培养模型

3.1 构建与评价

该模型通过各类细胞系在平板或半透膜（transwell插入板）上长成极密细胞层从而模拟胎盘的生理特性。通过对模式化合物在该模型中的相对转移速率与在体外胎盘灌注模型中的转移指数进行比较表明，二者具有良好相关性，验证了该模型的价值［18］。该模型多使用从人绒毛膜癌与恶性葡萄胎中分离出的BeWo，JEG 和JAR 细胞系，可在较短时间内传代并表达出与典型滋养层相同的激素分泌特性。近年来，JEG-3 通过鸟嘌呤核苷磷酸转移酶缺陷突变体AC1-1 与绒毛外滋养层细胞融合产生AC1-M32和AC1-M59或与早期滋养层细胞融合获得ACH-3P 细胞系［19］，能更完整的模拟出妊娠早期滋养细胞层的结构与功能。另一类常用细胞系可通过人工干预使原代滋养层永生化获得，包括感染逆转录病毒载体的孕早期绒毛外滋养细胞（extravillous cytotrophoblast，ev CTB）发展而来的HTR-8/SVneo 与通过诱导端粒酶活性获得的Swan71，此类是目前研究胞外滋养层细胞侵袭、迁移和增殖的最常用细胞系［20］。

该模型为研究胎盘转运提供更简便、快速的构建方法，可替代、减少毒性测试中的离体胎盘与动物模型的使用；其成本相对较低耗时短、技术较易掌握，但缺乏生理复杂性和在体细胞微环境。而常用的BeWo 等细胞来源于恶性肿瘤，与正常滋养层细胞存在一定区别。永生化细胞系虽然能够延长细胞增殖的时间但失去了一些滋养层特有的调控特性，故相关研究仅能模拟胎盘的部分机制。

3.2 应用

滋养层细胞培养模型临床常用于妊娠毒理学研究。通过该模型发现左氧氟沙星、氧氟沙星、吲哚美辛、安替比林和咖啡因等外源化合物可被转运至胎儿侧［21-22］。近年来，有研究采用该模型发现，地高辛纳米颗粒的P-gp介导的外排作用较低，比游离地高辛的胎盘渗透性高、对母体影响小，为临床治疗胎儿心血管疾病提供了一种新型治疗策略［23］。Widhalm 等［24］利用HTR-8/SVneo 细胞系发现胎盘可通过上调二价金属转运蛋白1、锌铁调控蛋白1（ZRTand IRT-like protein1，ZIP1）和ZIP8 拦截金属镉以减少向胎儿侧的运输但同时会损伤其本身功能并对胎儿产生潜在危害，而蛋白MT2A 结合镉激活金属转录因子1 诱导其下游靶标，具有有限的保护胎儿的作用。Profita 等［25］使用该细胞系评估了作为双酚A的细胞毒性，表明其通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAPK）/细胞外信号调节激酶（extra cellular signal-regulated kinase，ERK）介导影响细胞的增殖和迁移过程，说明BPA 会诱导炎症反应，提示在妊娠期间慎应用双酚类化合物。Martínez 等［26］分别使用BeWo和HTR-8/SVneo 细胞验证了香脂豆树（Copaifera multijuga）叶水醇提取物的抗寄生虫活性。将弓形虫使用水醇提取物和油树脂预孵育1 h，在之后3 或8 h 内与选定的2 种细胞相互作用，发现寄生虫黏附、侵入和在细胞内增殖能力降低，并检测出BeWo细胞中白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）上调与IL-8下调，提示香脂豆树叶水醇提取物可成为治疗先天性弓形虫病新型策略。这些研究对于深入了解妊娠期环境污染、寄生虫感染和使用化学物质对胎儿健康的潜在影响有重要意义。

4 人胎盘组织培养模型

此类模型主要分为胎盘绒毛外植体培养和质膜囊泡培养。Song 等［27］运用尤斯灌流室（Ussing chamber）和胎盘绒毛外植体薄片培养技术结合模拟在体环境进行造模，使其更接近人体胎盘的生理结构。鲁娣等［28］运用该模型进行中药透过胎盘屏障药物成分研究，发现黄芩有11种药物成分可透过胎盘屏障造成胎儿宫内暴露。该模型的研究方向主要集中于证明中药成分透过胎盘造成的胚胎发育毒性。但目前仍存在转运机制不明、可短暂体外培养但无法分裂增殖、建立病理性妊娠胎盘屏障模型困难等问题。

5 体外三维培养模型

近年来，随着人诱导多能干细胞分化技术的成熟、微流控技术和生物打印技术的进展，传统2D 模型中存在的一些缺陷在3D 胎盘屏障体外模型中得到了进一步完善。现阶段BPB 体外三维培养模型中类器官和胎盘微流控芯片是主流的2种方法。

5.1 类器官模型

5.1.1 模型构建方法

Turco 等［29］在2018 年提出并利用原代细胞滋养层细胞（cytotrophoblast cell，CTB）建立了长期稳定人体胎盘类器官模型，通过与JEG-3 体外细胞系模型进行阳性对照并利用质谱法检测胎盘特异性肽和激素的分泌，表明该方法保留了妊娠早期滋养层的特征，包括相似的转录组和全局甲基化谱，对研究人类早期胎盘发育、滋养层和系统母体环境之间的相互作用具有重要意义。而后Okae 等［30］利用离体CTB 分化胎盘干细胞构建特定模拟体内信号因子环境，自发形成具有自我更新能力的干细胞簇，并成功分化出功能细胞模型。Cinkornpumin等［31］通过诱导转化使原始人胚胎干细胞表现出源自人胎盘或囊胚的人滋养层干细胞（human trophoblast stem cells，hTSC）的细胞和分子表型，具有核心胎盘基因再激活能力。

5.1.2 应用

Karvas 等［32］利用hTSC 衍生的胎盘类器官模型判断与不良妊娠结局有关的病原体时发现，STB易受到SARS-CoV-2病毒的感染，而CTB更容易被寨卡病毒（zika virus，ZIKV）和水疱性口炎病毒影响，这将为后续临床开展妊娠抗病毒及药物治疗提供体外实验数据支持。利用该模型研究表明，6 种常规多酚中的天然化合物去氧土大黄苷元也通过与ZIKV 包膜（E）蛋白相互作用并下调ZIKV 受体含量，阻断ZIKV进入细胞，其表现出对ZIKV感染的强抑制性，具有良好的抗病毒效果，为临床妊娠期抗病毒药物的疗效评估提供了一种新方式［33］。

近期一项研究利用滋养层细胞模型BeWo 细胞系考察了抗癫痫药物对妊娠结局的影响，发现临床常用药物丙戊酸（alproacdic acid，VPA）会改变滋养细胞合体化相关基因的表达并影响其合体过程［34］；通过进一步与hTSC模型进行对比分析表明，hTSC 中的发育基因标志物MEFSD2A，CGB 等表达更为显著，并证实VPA 会降低MFSD2A 基因mRNA 水平，其表达量与新生儿体重、头围和胎盘重量之间呈正相关［30］。对抗癫痫药物的胎盘毒理学评估为预测后期胎儿发育风险提供了有意义的信息，同时这种对比造模的方法也证明了胎盘类器官模型在评估药物毒理学方向上的潜力。

5.2 胎盘微流控芯片模型

5.2.1 构建方法

2016 年该模型被首次报道［35］，是通过人工活性膜为人滋养层细胞与脐静脉内皮细胞提供组织分层结构进行生长，并在动态流动条件下形成的仿生微流控芯片模型，通过葡萄糖跨滋养层-内皮界面转运来测试胎盘屏障的生理功能与通透性，是类器官培养技术的补充和拓展，也更类似BPB 组织结构。Blundell等［36］提出建立转运蛋白介导的药物外排微流控模型用于研究肝素和格列本脲通过母胎界面的扩散，可再现外排转运蛋白的天然功能和胎盘的有限药物摄入能力，更准确预测人胎盘中的药物运输，拓展了其作为非临床药物疗效和药物安全性测试工具的潜在用途。

5.2.2 应用

Pemathilaka 等［37］测试了一种双通道设计以检查咖啡因穿过胎盘的转运，作为一种不能被发育中的胎儿完全代谢的分子，该研究可分别确定了母体和胎儿隔室达到稳态浓度所需的时间并确定了咖啡因的转运速率，对咖啡因从母体向胎儿转移程度提供了新见解，有助于判断孕妇日常可服用、无胚胎毒性的安全咖啡因量。Pemathilaka 等［38］同样利用该模型评估了阿片类受体拮抗剂纳曲酮和主要活性代谢物6β-纳曲醇在母胎两侧的透过性，以50 μL·h-1的流速向模型中通入293 mmol·L-1浓度的纳曲酮与291 mmol·L-1的6β-纳曲醇溶液并持续暴露8 h。与母体隔室初始浓度相比，胎儿隔室平均浓度仅为2.2%～2.5%，在通液6 h后细胞层开始受损，而上皮细胞层的IL-1α，IL-6 和肿瘤坏死因子α 及内皮细胞层中的IL-1α，IL-6和IL-8伴随胎儿室药物浓度升高而一同增加，这为深入探究纳曲酮对母体与胎儿的影响提供证据，也为后期评估其他药物的胚胎毒性提供了全新途径。Richardson等［39］创新性开发了同时具备STB，CTB 和内皮细胞层的三通道微流控芯片模型以测试他汀类药物的转运与扩散，普伐他汀在24 h 内通过葡糖醛酸化被细胞层全部代谢，而洛伐他汀在8 和24 h 内被CYP3A4 和CYP2D6 代谢；普伐他汀和瑞舒伐他汀都是减少与先兆子痫相关的炎症的潜在药物，而普伐他汀产生促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-4和IL-10，瑞舒伐他汀仅产生抗炎细胞因子IL-4，这表明瑞舒伐他汀在治疗先兆子痫相关炎症方面可能具有更好的效果。

5.3 评价和应用前景

基于人干细胞诱导自组织成三维结构的类器官模型，其包含了相应人体组织的复杂细胞结构和功能成分，克服了2D 培养模型在研究宿主-病原体相互作用、药理功能评估和毒理学评估方面的局限性。目前该模型的主要研究集中在胎盘本身与疾病母婴垂直传播的机制上，而胎盘类器官在药物毒性机制研究和妊娠安全用药筛选应用方面具有巨大潜力，值得进一步探究。

相较于其他体内外模型，胎盘微流控芯片模型能够更精准地模拟胎盘中的动态微环境，这一特性使其成为研究人类胎盘生理学的新趋势，也为相关妊娠药物的研究提供了一种全新且更符合伦理标准的方法。在模型建立上，目前经常使用BeWo30，ACH-3P 或JEG-3 等细胞系来代表母体通道侧的细胞。然而，由于细胞系的来源问题，尚不清楚相关细胞系是否能够完全代表胎盘母体侧功能，为解决这一问题，在未来的研究中可以尝试将不同滋养层类器官纳入胎盘芯片模型进行共同培养，这将进一步提高模型与人体生理相关性，并增强我们对不同人群中生物变异特性的评估能力。是目前需要更完善的模型来探索胎儿宫内暴露和发育的重要工具之一。

现阶段，我们对胎盘药物转移的量化数据和胎儿宫内暴露的潜在风险了解甚少，尤其是在最容易致畸的孕早期，因此一些学者构建出包括子宫肌层在内的人类母胎界面的空间分辨多组学单细胞图谱［40］，通过解析滋养层分化的完整轨迹，推测导致滋养层侵袭和受精卵着床的细胞通讯事件，为孕早期胎盘三维模型的设计与制作提供更多信息，也让构建完整的所处不同妊娠周期的BPB 体外三维模型成为可能，这将为妊娠各时期的母体安全用药与胎儿宫内治疗带来更多有益思考。

6 结语

目前，人们对药物在胎盘不同时期的转运机制与潜在胚胎毒性方面的了解较少。体外胎盘灌注模型作为经典模型对研究药物、疾病与环境对母胎的影响有较高的应用价值，但存在离体出现功能受损、维持活性时间有限的问题。体外滋养层细胞系与组织培养模型广泛应用于药物毒理学、滋养细胞增殖与凋亡等研究，但不能反映动态变化；三维培养模型是目前研究的热门方向，虽然由于对其认识不足、技术相对复杂而导致现阶段尚未广泛应用，但该类模型将有望在子宫内膜修复、妊娠并发症、胎盘损伤预测、药物转运机制、纳米新药物的研发、胎儿宫内治疗等方面取得更多突破。虽然体外三维BPB 模型还处于起步阶段，但通过持续发展并与目前更多先进手段结合，可能成为研究胎儿药物暴露及不同条件下人类BPB 生理和结构的新黄金标准，具有广阔的发展空间。建立与人体生理状态高度相关的BPB 体外模型对生命科学研究、组织器官重建、外源化合物对妊娠结局的影响、围产期新药研发等都具有重要意义。