美白祛斑精华液体外活性及人体功效评价研究

刘俊杰，史晓璇，王艳，王兰，杨珍，张秀君，李雪，赵心明，王鹏

（1.天津中医药大学，天津 301600；2.天津市中医药研究院附属医院，天津 300120；3.天津医科大学总医院，天津 300052；4.天津尚美化妆品有限公司，天津 300380）

笔者前期的研究发现，当将有强酪氨酸酶抑制作用的化合物和有强抗氧化作用的化合物进行复配会产生协同抑制酪氨酸酶的作用，比如白藜芦醇与氧化白藜芦醇复配减少皮肤由中波紫外线（UVB）导致的黑色素的生成，光甘草定和氧化白藜芦醇复配协同治疗黄褐斑[1-3]。

本文所研究的美白祛斑精华液即是在上述研究基础上，从中药中筛选出有协同抑制酪氨酸酶和抑制黑色素生成的组分中药，进行复配制备而成的产品，其中光果甘草提取物中的主要成分为光甘草定[4]，桑根皮提取物中的主要成分为白藜芦醇和氧化白藜芦醇[5]。本文就该产品的体外活性及美白祛斑效果和安全性进行研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 主要试剂和设备 TECAN 多功能酶标仪（美国Thermo Fisher 科技公司）、AL204 电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、VX-200 涡旋混匀器（Labnet International 公司）、恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）、智能孵化箱（德州市德城区永兴孵化设备厂）、人体防晒指数（SPF）测试系统Solar Light 601（北京鼎胜拓达科技有限公司）、色差仪CR400（广州卓谐仪器设备有限公司）、皮肤黑色素和红色素测试探头Mexameter®MX18（德国Courage+Khazaka electronic GmbH）、皮肤色卡（美国PANTONE 公司）。

无水乙醇（朝阳赫成化学试剂有限公司）、二甲基亚砜（赛默飞世尔科技公司）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，东京化成工业株式会社）、2，2'-联氨-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS，南京奥多福尼生物科技有限公司）、左旋多巴（纯度≥99%，上海生工生物工程股份有限公司）、酪氨酸酶（北京索莱宝科技有限公司）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6.8，北京索莱宝科技有限公司）、过硫酸钾（纯度≥99%，上海阿拉丁公司）、生理盐水（质量分数0.9%，石家庄四药有限公司）、0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液（上海麦克林生化科技股份有限公司）、净界之花美白祛斑精华液[（国妆持字G20220016），杭州比竹科技有限公司]，该精华液中含有2.0%白藜芦醇、0.8%光甘草定、0.2%红参提取物、0.2%红景天根提取物、0.2%光果甘草提取物、0.2%桑根皮提取物、0.2%水飞蓟提取物、3.0%甘油、0.04%四氢胡椒碱、3.0%植烷三醇、3.0%1，3-丙二醇、其余为丁二醇和去离子水。

1.1.2 实验鸡胚 无特定病原（SPF）级别芦花鸡受精鸡胚（新兴大华农禽蛋有限公司），购得的受精鸡蛋消毒后置于智能孵化箱中，温度（37.8±0.5）℃，相对湿度（60±5）%，每隔2 h 转蛋1 次，7 d 龄照蛋，弃去未受精、无活性或有缺陷的鸡胚。

1.2 方法

1.2.1 抗氧化实验

1.2.1.1 清除DPPH 自由基能力测定 参考羌宇等[6]的方法，加以改进。精密称取DPPH 粉末2.0 mg，用50 mL 无水乙醇溶解，得到DPPH 溶液。样品溶液的配制：取精华液适量，用无水乙醇溶液稀释成一系列浓度梯度备用。在96 孔板中加入100 μL DPPH溶液，再加入不同浓度的待测样品溶液，37 ℃恒温摇床避光孵育30 min，使用酶标仪在517 nm 波长处测定吸光度，平行测定4 次。加样情况，见表1。

表1 DPPH 自由基清除实验所需溶液及用量

DPPH 自由基清除率根据以下公式1 计算：

式中A 为空白组的吸光度；B 为样品组的吸光度；C 为对照组的吸光度。

1.2.1.2 清除ABTS 自由基能力测定 参考Dong等[7]和莫镜池等[8]的方法。精确称定192 mg ABTS 自由基粉末溶于50 mL 蒸馏水中得到7 mmol/L ABTS自由基溶液；准确称取33 mg 过硫酸钾溶于50 mL蒸馏水中得到2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液。将等体积比的7 mmol/L ABTS 自由基溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合均匀，放置黑暗处反应12 h 得到ABTS 自由基储存液。用50%乙醇水溶液稀释ABTS储存液，在734 nm 的波长下检测吸光度，使吸光度达到0.700±0.002 时得到ABTS 自由基工作液。样品溶液的配制：取精华液适量，用50%乙醇水溶液稀释成一系列梯度浓度备用。在96 孔板中加入100 μL ABTS 溶液，再加入不同浓度的待测样品溶液，37 ℃恒温摇床避光孵育10 min，使用酶标仪在734 nm 波长处测定吸光度，平行测定4 次。加样情况，见表2。

表2 ABTS 自由基清除能力测定所需溶液及用量

ABTS 自由基清除率根据以下公式2 计算：

式中A 为空白组的吸光度；B 为样品组的吸光度；C 为对照组的吸光度。

1.2.2 酪氨酸酶活性抑制实验 参考Wang 等[3]的实验方法。精确称取80 mg 左旋多巴粉末溶解于40 mL PBS（pH=6.8）中，避光超声10 min 即得左旋多巴溶液；精确称取酪氨酸酶粉末50 KU，加PBS定容至250 mL 棕色容量瓶中，即得活性为200 U/mL的溶液；样品溶液的配制：取精华液适量，用PBS 稀释成一系列浓度梯度备用。

向96 孔板中依次加入PBS、40 μL 不同浓度的待测样品溶液，40 μL 左旋多巴溶液，37 ℃恒温摇床避光孵育10 min，加入40 μL 酪氨酸酶溶液，继续孵育20 min，使用酶标仪在475 nm 波长处测定吸光度，平行测定4 次。加样情况，见表3。

表3 酪氨酸酶活性抑制实验所需溶液及用量

酪氨酸酶抑制率根据以下公式3 计算：

式中A、B、C、D 分别表示A、B、C、D 组反应液在475 nm 下的吸光度。

1.2.3 鸡胚胎绒毛尿囊膜实验（HET-CAM）评价眼部刺激性[9]受精鸡胚孵化至第9 天进行实验，分组为阴性对照组[质量分数为0.9%氯化钠溶液、刺激评分（Irritation score，IS）值为0]、阳性对照组（0.1 mol/L 氢氧化钠）和美白祛斑精华液组。阴性对照组和阳性对照组分别设置1 只鸡胚，美白祛斑精华液组设置6 只鸡胚。

照蛋检查气室位置，用镊子剥去气室蛋壳，暴露出白色卵壳膜，滴加0.9%NaCl 溶液润湿蛋膜显露血管，剥去蛋膜，露出尿囊膜（CAM）。肉眼观察CAM 的完整性及有无出血点的变化。如果有出血点或CAM 破损则剔除，不能用于进一步的测试。受试物均为透明液体，实验采用反应时间法。取0.3 mL 精华液，直接滴在CAM 表面，观察CAM 反应并记录作用后5 min 内每种毒性效应出现的时间。刺激性分类：IS<1，无刺激性；1≤IS<5，轻刺激性；5≤IS<9，中度刺激性；IS≥10，强刺激性/腐蚀性。

IS 值采用反应时间法进行试验，计算公式4如下

式中：sec H（出血时间）：CAM 上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒（s）；sec L（血管融解时间）：CAM 上观察到开始发生血管融解的平均时间，单位为秒（s）；sec C（凝血时间）：CAM 上观察到开始发生凝血的平均时间，单位为秒（s）。

1.2.4 临床功效测试

1.2.4.1 研究对象 选取33 例志愿者[测试部位肤色用来衡量皮肤亮度的指标个体类型角（ITA°）值在20°～41°]知情同意后入选。其中1 例因个人原因退出测试，最终有效数据32 例，男5 例，女27 例，年龄18～60 岁，平均（28.4±10.4）岁，符合志愿者入选标准。纳入标准：①年龄18～60 岁；②配合度较好，沟通能力较好，按要求使用产品并完成随访。排除标准：①妊娠期或者哺乳期女性；②对化妆品有过敏或者高度敏感风险者；③受试部位有急性炎性反应、免疫缺陷或其他皮肤病者；④近2 个月内参加药物临床试验者或其他化妆品功效评价者；⑤6 个月内接受过任何形式的皮肤治疗，试验期间可能长期暴露于紫外线下（如旅游、度假）导致日晒增加者；⑥试验期间受试部位应用抗炎药物，全身应用糖皮质激素及免疫抑制剂类药物者；⑦不能严格遵守试验要求、配合试验者。

1.2.4.2 环境条件 测试过程中，在温度为（21±1）℃，相对湿度为（50±10）%RH 的条件下进行视觉评估和仪器测试。视觉评估在恒定光照（色温5 500～6 500 K荧光管或LED 灯）下进行。在评估和测试之前，受试者需要适应这个环境至少30 min。

1.2.4.3 测试方法 采用随机、开放临床试验设计，使用紫外线诱导人体皮肤黑化模型祛斑美白功效测试法，该方法是《化妆品安全技术规范》（2015 年版）在2021 年5 月1 日修订后新增的人体功效评价检验方法中化妆品祛斑美白功效测试方法的第一法[10]。

具体操作如下：首先应确定每个志愿者背部皮肤在一定的光源和距离下接受光照后24 h 产生肉眼刚可观察到的最小红斑量（MED）。然后，在试验部位选定各测试区域，用日光模拟仪在同一照射点以0.75 倍MED 剂量照射1 次/d，连续照射4 d。照射结束后4 d 是皮肤黑化期，没有任何治疗。照射后第5 天，剔除ITA°值在所有测试区域平均值中>5的区域。

以色差仪测试L*a*b 颜色空间数值计算ITA°值，计算公式见式5。

按照随机表在黑化试验小区内施药。每个黑化测试区面积应≥0.5 cm2。按照随机表对应测试区进行美白祛斑精华液的涂抹，涂样面积应≥6 cm2，涂样量为（2.00±0.05）mg/cm2。每个测试区之间的间隔应≥1.0 cm。涂抹2 次/d，连续使用28 d，涂抹间隔时间不少于4 h/次。受试者连续应用4 周，并在应用后1、2、3 和4 周对皮肤颜色进行视觉评估和仪器测试，并记录数据。分组如下：①美白祛斑精华液组；②阴性对照组，黑化区空白对照；③阳性对照组，7%抗坏血酸（维生素C）制品（4 ℃冷藏，铝管避光保存）。

ITA°：皮肤色差仪测得，ITA °值越大，皮肤越明亮。

黑色素含量（MI）：黑色素探头测得，MI 值越大，皮肤黑色素含量越多。

视觉评估：皮肤色卡肉眼观察所得。

1.2.4.4 判断依据 试验产品涂抹前后任一时间点的颜色视觉评分差值或ITA°差值或MI 差值与阴性对照相比差异有统计学意义（P<0.05），或经回归系数分析后总体判断试验产品皮肤变黑情况与阴性对照相比差异有统计学意义（P<0.05），则判定试验产品有祛斑美白功效，否则判定试验产品无祛斑美白功效。

1.3 统计学分析 应用SPSS 软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行正态分布检验，符合正态分布的要求。自身前后比较采用配对t 检验，不符合正态分布的要求则采用两两相关样本秩和检验；等级资料使用前后的比较采用两两相关样本秩和检验；对照区和测试区之间的比较采用独立样本t 检验或秩和检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 美白祛斑精华液体外抗氧化能力 DPPH 自由基清除实验和ABTS 自由基清除实验被广泛应用于抗氧化能力的测定。精华液清除DPPH 自由基的实验结果如图1A 所示，精华液清除DPPH 自由基的半抑制浓度（IC50）值是0.955 mg/mL，精华液清除ABTS 自由基的实验结果如图1B 所示，其清除ABTS 自由基的IC50值是0.480 mg/mL，由此说明美白祛斑精华液有较好的体外抗氧化活性。

图1 精华液清除自由基能力

2.2 抑制酪氨酸酶活性 酪氨酸酶是调控黑色素生成的限速酶，抑制酪氨酸酶是减少黑色素产生的主要策略之一，精华液抑制酪氨酸酶的实验结果见图2。精华液抑制酪氨酸酶的IC50值是0.603 mg/mL，表现出较强的酪氨酸酶抑制能力。当施用浓度>2.500 mg/mL 时，抑制酪氨酸酶活性的能力趋于平衡。

图2 精华液酪氨酸酶活性抑制能力

2.3 HET-CAM 结果 根据反应时间法计算，阳性对照组在加入0.1 mol/L 氢氧化钠5 s 后出现出血现象，后陆续出现凝血和血管融解的现象，属于强刺激性；美白祛斑精华液组和阴性对照组的IS 值均为0.07，属于无刺激。在美白祛斑精华液作用于CAM的5 min 中，未观察到血管出血、凝血和血管融解的现象。由此表明美白祛斑精华液无眼部刺激性，实验结果见图3、表4。

表4 HET-CAM 检测各组溶液的刺激评分结果

图3 HET-CAM 结果

2.4 美白祛斑精华液临床功效测试结果

2.4.1 美白祛斑精华液使用前后视觉肤色评估差值 使用产品不同时间后皮肤明亮度测试结果见表5。美白祛斑精华液组和阳性对照组的视觉肤色评分在使用后第1，2，3，4 周，相较于阴性对照组差异无统计学意义（P>0.05）。美白祛斑精华液组第4周相较于黑化后的肤色改善了5.72%，阳性对照组改善了4.50%。

表5 不同试验时期肤色视觉评分差值 （±s）

测试时间 n 阴性对照组 美白祛斑精华液组 阳性对照组测定值 变化率（%） 测定值 变化率（%） 测定值 变化率（%）1 周2 周3 周4 周32 32 32 32 0±0 0 0±0 0 -0.03±0.18 -0.39 0.03±0.18 0.41 0.16±0.37 2.08 0.13±0.34 1.72 0.25±0.44 3.28 0.31±0.47 4.03 0.22±0.42 2.91 0.31±0.48 4.07 0.44±0.56 5.72 0.34±0.54 4.50

2.4.2 美白祛斑精华液使用前后脸颊皮肤明亮度变化 使用美白祛斑精华液不同时间点ITA°值差值（△ITA°值）结果，见表6。△ITA°值越大，说明皮肤透亮度变化越大，志愿者在使用美白祛斑精华液后，皮肤明亮度呈持续增长趋势。使用产品1 周后，皮肤明亮度增加30.31%（P<0.001），坚持使用4 周后，皮肤明亮度比使用前显著增长97.12%（P<0.001）；阳性对照组相较于阴性对照组差异有统计学意义（P<0.001）。阳性对照组第4 周△ITA°值相较于第0周提升了79.90%，说明美白祛斑精华液可显著提升皮肤明亮度。

表6 不同试验时期皮肤△ITA°值 （±s）

表6 不同试验时期皮肤△ITA°值 （±s）

注：与阴性对照组相比较，***P<0.001。

测试时间 n 阴性对照组 美白祛斑精华液组 阳性对照组测定值 变化率（%） 测定值 变化率（%） 测定值 变化率（%）1 周2 周3 周4 周32 32 32 32-1.22±1.13 -12.67 2.69±1.53*** 30.31 2.06±1.50*** 22.51-1.03±1.35 -10.70 4.34±1.91*** 48.90 3.94±2.06*** 43.06-0.66±1.64 -6.85 6.66±2.28*** 75.04 5.84±2.38*** 63.82-0.41±1.36 -4.26 8.62±2.34*** 97.12 7.31±2.75*** 79.90

2.4.3 美白祛斑精华液使用前后脸颊皮肤黑色素含量变化 使用美白祛斑精华液后不同时间皮肤MI 值测试结果见表7。坚持使用4 周后，与阴性对照组相比较，美白祛斑精华液组黑色素含量减少了14.46%（P=0.007），阳性对照组减少了19.06%（P<0.001）。说明美白祛斑精华液使用4 周后能有效降低皮肤黑色素含量。

表7 不同试验时期皮肤△MI 值 （±s）

表7 不同试验时期皮肤△MI 值 （±s）

注：与阴性对照组相比较，**P<0.01，***P<0.001。

测试时间 n 阴性对照组 美白祛斑精华液组 阳性对照组测定值 变化率（%） 测定值 变化率（%） 测定值 变化率（%）1 周2 周3 周4 周32 32 32 32 0.81±15.74 0.49 2.47±18.87 1.51 11.31±13.31** 6.62 3.53±14.59 2.14 7.78±18.21 4.77 18.90±12.15*** 11.06 5.84±14.75 3.54 13.78±17.41 8.44 24.50±13.63*** 14.34 11.21±17.17 6.68 23.59±18.07** 14.46 32.56±16.41*** 19.06

3 讨论

本试验证明美白祛斑精华液有良好的体外抗氧化能力，可以清除DPPH 和ABTS 自由基；有较强的抑制酪氨酸酶活性的能力。通过HET-CAM 证明了该精华液对眼部无刺激性。美白祛斑功效宣称的评价方法应科学、合理，首要选择已有的技术规范方法[11]。紫外线（UV）诱导人体皮肤黑化模型祛斑美白功效测试法为国家标准，该测试法评价的结果更科学有效[10]。人体试验结果可见，使用美白祛斑精华液4 周后，与黑化后的皮肤相比较，肤色改善了5.72%，ITA°值增加了97.12%，MI 减少了14.46%，该精华液有良好的美白祛斑效果，尤其是在皮肤提亮方面。

中药有效成分如熊果苷、光甘草定、白藜芦醇等作为酪氨酸酶抑制剂被广泛应用于美白化妆品中[12]，但光甘草定、氧化白藜芦醇和白藜芦醇溶解度差，在化妆品中添加量有限，那么在无法提高活性物质添加量的情况下，提高活性物质之间的协同性是提高产品功效的有效解决途径。本课题组发现以L-DOPA 为底物时，光甘草定和白藜芦醇复配溶液抑制酪氨酸酶活性的能力较光甘草定溶液提高41.67%，复配较单独使用抑制酪氨酸酶活性增强，表现出协同抑制酪氨酸酶作用[3]。同时细胞实验发现白藜芦醇与氧化白藜芦醇复配可以协同减少细胞中黑色素的生成[2]。动物实验还发现光甘草定和氧化白藜芦醇复配有协同治疗黄褐斑的作用[1]。本文中的美白祛斑精华液是在既往研究基础上得到的产品，其中含有光果甘草提取物中的主要成分光甘草定和桑根皮提取物中的主要成分白藜芦醇、氧化白藜芦醇[4]，并添加了红参和红景天提取物等多种中药提取物，红景天已被证实有良好的抑制酪氨酸酶的作用[13]，而红参则在抗衰老和抗氧化方面效果显著，被应用于各种护肤品中[14]。实验结果也很好地证明了该精华液有美白祛斑的效果。因此，本研究验证了美白祛斑精华液的功效和安全性，也为以后的美白祛斑类化妆品的开发提供了很好的参考和借鉴。