真菌性角膜炎诊治方法的研究进展

胡嘉纯 高娜

真菌性角膜炎是一种好发于亚洲及非洲,在年轻男性中发病率较高,由真菌感染所致,可能导致角膜损伤、眼内感染甚至失明的十分凶险的眼部疾病[1]。有研究表明至少30%的真菌性角膜炎患者会出现角膜穿孔或是药物治疗无效的情况,因此早期诊断以及合理预防对于治疗真菌性角膜炎有着重要的作用[2]。现对真菌性角膜炎诊断及治疗的研究进展进行阐述。

1 真菌性角膜炎的诊断

1.1 传统诊断方式

真菌性角膜炎的传统诊断方式主要有显微镜检查以及微生物培养,此二者现阶段仍然是实验室诊断的金标准[3]。然而这两种诊断方式都具有一定的局限性,首先两种方式都存在假阴性的可能,并且都以有创性组织取样为基础。再者,显微镜检查的检出结果会受到病灶大小以及取材量的影响,微生物培养又往往需要数日甚至数周的培养时间,对于深层浸润的病灶检出率较低。

这些局限性都在某种程度上影响了真菌性角膜炎的早期诊断,于是随着人们研究的深入,能够缩短诊断时间或是拥有更高特异性的诊断方式不断涌现。

1.2 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)

运用PCR检测诊断真菌性角膜炎也基于角膜刮片,这是一种将微量基因提取物放大扩增后与数据库对照从而推断病原体种类的分子生物学技术,仅需要极少量的样本便能较快的进行诊断。Ferrer等人[4]在10年间使用涂片镜检、培养和PCR(其中PCR检测和分子鉴定是通过DNA阳离子对角膜样本的ITS和5.8S rRNA区域进行测序)对20名确诊真菌性角膜炎患者的27个角膜样本进行检测。在27例真菌性角膜炎患者样本中,PCR检测阳性率高达92.6%并且这些阳性结果在4～8小时内产生,而微生物培养中真菌的需要1～35天的时间;此外,PCR检测时仅无法识别一个角膜样本的物种,而使用常规技术时,仅能识别8名患者的致病菌。但是PCR只能检测已知DNA序列和引物的生物体,无法评估临床治疗效果,并且需要更加高昂的成本。

1.3 角膜激光共焦显微镜检查(IVCM)

角膜共焦显微镜检查是一种非侵入性的角膜成像检查,能够进行实时诊断。Y E Wang等人[5]的研究表明,IVCM能够迅速准确的诊断感染性角膜炎,并且对真菌性角膜炎的诊断具有极高的特异性及敏感性,同时能够根据菌丝数量等评估疾病进展情况评价疗效。Hoffman等人[6]的研究也得出了相似的结论,与PCR以及微生物培养相比,IVCM对于诊断真菌性角膜炎的敏感性高达81.8%,远高于PCR及微生物培养。

除此之外,一系列研究表明在IVCM图像中曲霉菌的菌丝直径为3～10微米,平均长度为200～400微米,菌丝分支角度为45度,而镰刀菌的菌丝直径为3～5微米,平均长度为200～300微米,菌丝分支角度为90度[7]。这提示我们,IVCM不仅能够区别不同种类的微生物,甚至能够区分真菌菌属的种类。但在Tabatabaei等人[8]的一项研究中通过IVCM没有观测到曲霉菌与镰刀菌菌丝分支角度的明显差异,对于IVCM是否能够准确辨别真菌菌属仍需要进一步的临床研究来确认。

1.4 其他分子诊断方式

近年来,在感染性角膜炎的诊断中,分子诊断逐渐崭露头角。除了前文中所提到的PCR以外,还出现了许多基于PCR方法的分子诊断方法。比如宏基因组深度测序(MDS)是通过提取样本中全部RNA,通过16个PCR周期扩增放大之后进行测序,耗时约5～7天,能够提高真菌性角膜炎诊断的敏感性与准确度。Lalitha等人[9]通过潜在类别分析(LCA),评估了常规诊断、DNA测序和RNA测序的敏感性和特异性,RNA测序对对真菌病例具有100%的敏感性和97%的特异性远高于KOH/革兰氏染色(70%)、微生物培养(52%)以及MDS(74%)。

还有一种早期仅被用于细菌诊断的分子诊断方法,即MALDI-ToF Mass Spectrometry,通过质量普的不同鉴别微生物,现已被用来鉴别真菌菌种,尤其被广泛运用于酵母菌、丝状真菌属、曲霉菌、青霉菌、镰刀菌以及粘液菌的鉴定[10]。同样存在仅能鉴别已有质量谱数据的真菌菌种的局限性。另外通过泪液蛋白组学方法,即通过对不同治疗阶段患者泪液样本进行分析,能够获取真菌性角膜炎患者眼表防御及损伤的全面信息,这对于确定真菌性角膜炎的临床进程及疗效情况有着一定指导性意义[11]。

分子诊断方式不断开拓我们对疾病的认识与诊断,但它们往往具有相类的局限性,具体表现为价格高昂、可供查阅的对照数据库内容有限等,仍需要不断探索,以期实现真菌性角膜炎便捷而又准确的诊断。

2 真菌性角膜炎的治疗方式

2.1 局部药物治疗

用于治疗真菌性角膜炎的外用药物主要包括5%那他霉素、0.15%～0.3%两性霉素B、1%伏立康唑、1%益康唑、1%伊曲康唑以及1%咪康唑[12]。那他霉素是唯一一种被美国食品药品监督管理局批准用于眼部的局部抗真菌药物,其对于镰刀菌属、曲霉菌等多种真菌所致的真菌性角膜炎疗效显著。两性霉素B是一种多烯类抗真菌药物,虽然具有潜在毒性,但其广谱活性、低耐药性以及良好的临床疗效,被用于治疗侵袭性真菌感染已超过50年,是酵母菌感染所致真菌性角膜炎的首选治疗药物[12]。伏立康唑被认为是一种优秀的那他霉素替代品,有良好的眼部渗透性,具有较高的生物利用度,对全身及局部均有效,但存在导致视觉障碍、色觉障碍或对光敏感性增加等副作用[13]。

除了常规的抗真菌药物,一些防腐剂或消毒剂,具有广谱抗菌活性,可以对抗细菌、酵母菌、霉菌和某些病毒,Pinna等人[13]的体外研究评估了0.05%己脒定二羟乙基硫酸盐溶液以及0.6%聚维酮碘的抗菌活性,发现它们都对念珠菌属有较强的抗菌活性。在尼泊尔的一项试验比较了0.2%洗必泰与5%那他霉素对于真菌性角膜炎的治疗效果,虽然0.2%的洗必泰无法取代5%那他霉素成为治疗真菌性角膜炎的一线药物,但是其对真菌性角膜炎也存在切实的疗效[14],基于其价格低廉较易获取的特点,对于经济落后地区也不失为一种治疗手段。

为了提高治疗效果,这些局部滴眼液在真菌性角膜炎的治疗中常常并非单独使用,联合使用能够增加疗效,比如那他霉素和伏立康唑联合使用表现出更高的抗真菌活性。

2.2 基质内注药

除了药物联合使用外,不同给药途径也能增加药物作用时间及浓度从而提高疗效,减轻并发症反应。

Narayana等人[15]的随机对照研究评估了基质内注射1%伏立康唑对中重度丝状真菌性角膜炎的疗效,比较第三天和第七天培养阳性率以及最终疤痕大小,与仅使用5%那他霉素滴眼液治疗相比,联合基质内注射伏立康唑的受试者角膜穿孔率降低。另一项前瞻性随机临床试验比较了基质内注射那他霉素、伏立康唑以及两性霉素B的疗效,其中基质内注射那他霉素的治疗组恢复时间更快[16]。

2.3 其他辅助治疗手段

另外还有一些辅助手段能够提高药物作用效果。Roy等人[17]研究表明两性霉素B的微针眼贴片在离体和活体真菌性角膜炎兔子模型中均有良好的表现,提高了两性霉素B的眼部渗透性。有研究和病例报告表明常用于圆锥角膜、透明边缘性角膜变性以及大疱性角膜病变等角膜扩张性疾病的治疗方法角膜胶原胶联能够增强抗真菌药物的眼部渗透性,是治疗真菌性角膜炎的有效辅助疗法[18]。一项对41名真菌性角膜炎患者的随机研究中,角膜胶原胶联作为局部药物治疗的辅助治疗,加快了浸润灶的愈合速度,缩短了用药时间及用药强度[19]。近期Jian He等人[20]一项研究表明使用可视化镓/溶壁酶整合抗菌剂在小鼠真菌性角膜炎模型中取得了比两性霉素b更好的疗效,该方式通过降解真菌的细胞壁和生物膜基质中的β-葡聚糖等胞外多糖从而有效杀灭真菌。

2.4 全身药物

全身抗真菌药物主要作为外用药物的辅助治疗,适用于大小>5 mm、基质深度>50%的溃疡或是顽固性感染、双眼感染、巩膜炎、角膜缘受累、眼内炎、儿童、角膜移植术后以及即将发生角膜穿孔的病例[21]。全身抗真菌药物虽然常常是辅助治疗,但单独使用也有较好的疗效。一组病例表明,仅口服伏立康唑(200 mg bid)治疗真菌性角膜炎,能够减轻症状、清除微生物,对真菌性角膜炎有显著疗效[22]。一份来自伊朗的关于眼部真菌对唑类药物敏感性的报告显示,伏立康唑及伊曲康唑的衍生物泊沙康唑对大多数镰刀菌属、曲霉菌属以及酵母菌属都具有优异的抗真菌活性,不过对曲霉菌属及弯孢霉属的最低抑菌浓度较高[23]。Ferguson等人[24]的一组病例报告表明,大剂量口服泊沙康唑(500～600 mg qd)对常规药物治疗无效的真菌性角膜炎(两例镰刀菌属和一例青霉菌属)能迅速起作用,并且在这组病例中大剂量泊沙康唑治疗未发现明显的全身副作用。大剂量使用的全身抗真菌药物或将成为常规治疗无效的真菌性角膜炎的突破口。

2.5 手术治疗

真菌性角膜炎患者行治疗性穿透性角膜移植(TPK)手术治疗的常见适应症包括角膜穿孔、即将穿孔以及保守治疗无效的顽固性角膜炎,然而角膜移植术后的再次感染是真菌性角膜炎的发生率在6%到16%之间,由于担心再次感染往往会在角膜移植术后延迟使用类固醇滴眼剂的时间,这又可能导致炎症反应重,移植物失代偿以及新生血管生成。在最近的一项临床研究中,Chatterjee等人[25]在真菌性角膜炎TPK术后早期利用0.1%环孢素A滴眼剂替代类固醇滴眼剂,研究结果表明这样既可以提高植片存活率及术后视力也能够降低再次感染的风险,这或许将会提升真菌性角膜炎手术治疗成功率。

2.6 综合治疗

真菌性角膜炎的治疗是一个复杂的过程,在临床往往需要局部、全身以及手术治疗适当结合。Sharma等人[21]便用“局部、全身和靶向治疗方案”治疗了223例真菌性角膜炎,首先所有病例在最初局部使用5%那他霉素每小时一次,48小时后减少为每两小时一次直到溃疡灶完全重新上皮化再减为每四小时一次,持续三周。若是在治疗的第7～10天效果不佳则局部增加1%伏立康唑与那他霉素同频率使用,若再过七到十天仍疗效不佳则每隔72小时在基质内注射伏立康唑(最多4次)。除此之外,对于溃疡灶大小>5 mm、深度>50%或即将穿孔的病例,则额外口服200 mg伏立康唑或酮康唑每天两次。对于治疗无效或是角膜穿孔的病例则进行TPK,此方案的成功率为79.8%。这项研究提供了一个可供参照的循序渐进的治疗方案。

3 结语

真菌性角膜炎的诊断和治疗仍面临着一些困难与挑战,纵观数十年来对于真菌性角膜炎研究的发展轨迹,能够达成共识的高效诊疗方式较少。现阶段一些分子诊断方法以及一些辅助治疗手段不断涌现,真菌性角膜炎的诊断已经入分子时代,,但是迄今为止仍然缺少对真菌性角膜炎治疗的明确指导。对于真菌性角膜炎的早期诊治方式仍需我们继续探索,提升早期诊断率以及治疗的成功率,降低角膜穿孔及失明等严重并发症发生机率。