超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-质谱法鉴定舒肝散成分*

刘晓俊，张 娥，董丽荣，杨汝琪，赵艳丽

（1. 云南省昆明市食品药品检验所，云南 昆明 650200； 2. 昆明学院，云南 昆明 650214； 3. 云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650200）

舒肝散由当归、白芍、柴胡、香附、白术、茯苓、栀子、牡丹皮、薄荷、甘草10 味药材组方，具有舒肝理气、散郁调经功效，可用于肝气不舒的两肋疼痛、胸腹胀闷、月经不调、头痛目眩、心烦意乱、口苦咽干，以及肝郁气滞所致面部黄褐斑［1-2］。中药复方制剂成分复杂，其有效成分较模糊，药效物质基础不明确，难以保证临床安全、有效使用［3］。舒肝散现行标准WS-10158（ZD-0158）-2002《国家食品药品监督管理局国家标准 舒肝散》仅以薄层色谱法对其中的当归、香附、白术进行鉴别，并采用高效液相色谱法测定栀子苷的含量。近年来，超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-质谱（UHPLCQ - TOF - MS）法被广泛用于代谢组学研究［4-5］。本研究中采用UHPLC - Q - TOF - MS 法分析舒肝散中多种成分，获得多级碎片离子，参考文献［6 - 11］和数据库信息，分析特征化合物的精准分子量、化学结构、化合物的裂解方式等，从而快速、准确地鉴定出舒肝散的有效成分，进一步阐明了该复方制剂的物质基础，为提高舒肝散制剂质量提供了参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

X500R QTOF 型高分辨率飞行时间质谱仪（美国Sciex公司）；LC30AD型超高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有岛津lc30ad 型超高效液相色谱系统；Chorus LC216-LC134 型超纯水制备仪（威立雅水处理技术有限公司）；AL104 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为万分之一）；SONOREX RX255 型超声波清洗仪（德国Bandelin公司，功率为640 W，频率为35 kHz）。

1.2 试药

舒肝散（昆明中药厂有限公司，编号为S1-S3）；甲醇、乙腈均为色谱纯，甲酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC - C18柱（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min 时90%A，3～15 min 时90%A →30%A，15～18 min 时30%A →10%A，18～19 min 时10%A →90%A，19～23 min 时90%A）；流速：0.25 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

2.1.2 质谱条件

电离源：电喷雾电离（ESI）源；雾化气压力：0.379 MPa；辅助气压力：0.379 MPa；气帘气压力：0.241 MPa；雾化器温度：550 ℃；质量范围质荷比（m/z）50～1 000；正离子模式下，毛细管电压为5 500 V，去簇电压为80 V，碎裂电压为（30 ± 15）V；负离子模式下，毛细管电压为4 500 V，去簇电压为80 V，碎裂电压为（-30±15）V。

2.2 供试品溶液制备

取样品（编号为S1 - S3）各5 g，精密称定，分别置25 mL 容量瓶中，加10 mL 70%甲醇超声15 min 使溶解，冷却后加70%甲醇稀释并定容，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.3 样品中化合物分析

2.3.1 整体分析

取2.2 项下供试品溶液，按2.1 项下色谱与质谱条件进样分析，获得正、负离子模式下供试品溶液的UHPLC-Q-TOF-MS 基峰色谱图（图1），通过文献比对、同位素分布、数据库检索、二级碎片裂解规律分析，共鉴定出22 种化合物（表1），其中黄酮类化合物6 种、有机酸类化合物3 种、萜类化合物7 种、酚酸类化合物5 种、其他类化合物（姜糖酯B）1种。

表1 舒肝散中化合物鉴定结果Tab.1 Identification of chemical components in Shugan Powder

图1 舒肝散在正、负离子模式下的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-质谱基峰色谱图A.Negative ion mode B.Positive ion modeFig.1 UHPLC-Q-TOF-MS BPC chromatograms of Shugan Powder with positive and negative ion modes

2.3.2 黄酮类化合物

黄酮类化合物是一类具有多种药用价值的植物次生代谢活性物质［6］。样品中共鉴定出6 种黄酮类化合物，分别为儿茶素、夏佛塔苷、异甘草素、柚皮素、异鼠李素、光甘草定。

以异鼠李素为例，该化合物保留时间为3.88 min，一级质谱信息显示，其在负离子模式下响应较好，并得到m/z315.051 2的准分子离子峰［M-H］-，经Sciex OS软件（以下简称为软件）拟合，其分子式为C16H12O7，该化合物二级质谱碎片信息有m/z300.027 5，m/z227.035 5，m/z164.011 7，m/z151.003 6，发现其断裂方式符合黄酮类化合物断裂规律，通过软件拟合断裂碎片及比对二级碎片信息，最终确定该化合物为异鼠李素。异鼠李素二级质谱图及化合物裂解过程见图2。

图2 异鼠李素二级质谱图及可能的裂解途径A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.2 Secondary mass spectrogram of isorhamnosin and its possible pyrolysis pathway

2.3.3 酚酸类化合物

酚酸类化合物具有酚羟基，在负电压下易丢失氢离子［7-8］。样品中共鉴定出5种酚酸类化合物，分别为原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸、3，4-二咖啡奎宁酸、阿魏酸。

以迷迭香酸为例，一级质谱信息显示，该化合物在负离子模式下响应较好，母离子m/z359.077 3，经软件拟合，其分子式为C18H16O8，该化合物二级质谱碎片信息有m/z197.045 6，m/z161.024 7，m/z133.029 5，m/z72.993 2，发现其断裂方式符合酚酸类化合物断裂规律，通过软件拟合断裂碎片及比对二级碎片信息，最终确定该化合物为迷迭香酸。迷迭香酸二级质谱图及裂解过程见图3。

图3 迷迭香酸二级质谱图及可能的裂解途径A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.3 Secondary mass spectrogram of rosmarinic acid and its possible pyrolysis pathway

2.3.4 萜类化合物

萜类化合物是一类植物、动物、微生物中广泛存在的化合物，具有不饱和碳碳键［9-10］。样品中共鉴定出7种萜类化合物，分别为栀子苷、芍药苷、西红花苷、柴胡皂苷B2、灵芝酸DM、茯苓酸、熊果酸。

以栀子苷为例，该化合物保留时间为2.07 min，一级质谱信息显示，其在负离子模式下响应较好，并得到m/z387.130 2 的准分子离子峰［M - H］-，经软件拟合，其分子式为C17H24O10，该化合物二级质谱碎片信息有m/z342.131 5，m/z226.084 1，m/z207.066 0，m/z164.068 5，发现其断裂方式符合环烯醚萜类化合物断裂规律，最终确定该化合物为栀子苷。栀子苷二级质谱图及裂解过程见图4。

图4 栀子苷二级质谱图及可能的裂解途径A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.4 Secondary mass spectrogram of gniposide and its possible pyrolysis pathway

以芍药苷为例，该化合物保留时间为2.63 min，一级质谱信息显示，其在负离子模式下响应较好，并得到m/z479.156 4 的准分子离子峰［M - H］-，经软件拟合，其分子式为C23H28O11，该化合物二级质谱碎片信息有m/z327.108 1，m/z165.055 6，m/z121.029 4，m/z77.039 7，发现其断裂方式符合单萜类化合物断裂规律，最终确定该化合物为芍药苷。芍药苷二级质谱图及裂解过程见图5。

图5 芍药苷二级质谱图及可能的裂解途径A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.5 Secondary mass spectrogram of paeoniflorin and its possible pyrolysis pathway

以茯苓酸为例，该化合物保留时间为6.35 min，一级质谱信息显示，其在负离子模式下响应较好，并得到m/z527.373 2 的准分子离子峰［M - H］-，经软件拟合，其分子式为C33H52O5，该化合物二级质谱碎片信息有m/z465.337 1，m/z431.280 7，m/z221.199 1，m/z59.013 9，发现其断裂方式符合三萜类化合物断裂规律，最终确定该化合物为茯苓酸。茯苓酸二级质谱图及裂解过程见图6。

图6 茯苓酸二级质谱图及可能的裂解途径A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.6 Secondary mass spectrogram of tuckaholic acid and its possible pyrolysis pathway

2.3.5 有机酸类化合物

有机酸是一类具有酸性基团的有机化合物，如羟基（— COOH）、酚羟基（— C6H6O）、磺酸基（— SO3H）、亚磺酸基（—RSOOH）、硫羰酸基（—RCOSH）等［11］。样品中共鉴定出3 种有机酸类化合物，分别为柠檬酸、亚油酸、16α-羟基松苓新酸。

以柠檬酸为例，该化合物保留时间为0.81 min，一级质谱信息显示，其在负离子模式下响应较好，并得到m/z191.020 1 的准分子离子峰［M - H］-，经软件拟合，其分子式为C6H8O7，该化合物二级质谱碎片信息有m/z129.019 1，m/z111.008 7，m/z87.008 7，发现其断裂方式符合有机酸类化合物断裂规律，最终确定该化合物为柠檬酸。柠檬酸二级质谱图及裂解过程见图7。

图7 柠檬酸二级质谱图及可能的裂解途径A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.7 Secondary mass spectrogram of citric acid and its possible pyrolysis pathway

3 讨论

3.1 前处理方法选择

供试品溶液制备方法考察中，分别考察了以100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、水为提取溶剂，振摇15 min 与超声15 min 2 种提取方法对舒肝散提取效果的影响。结果表明，以70%甲醇为提取溶剂，超声15 min处理的供试品溶液的色谱信息最丰富，适用于化合物成分分析。

3.2 扫描模式选择

本研究中采用信息依赖扫描（IDA）模式，正、负离子模式分开采集数据，负离子模式下质谱响应强度及峰数大于正离子模式。分析原因，舒肝散中含有大量植物代谢产物，这类物质大多属有机酸类、酚类、萜类，这些类型的化合物含有大量的羧基及羟基，在负离子模式下易失去氢离子而获得较好响应。正、负离子模式分开采集提高了采集信息的丰富度，有助于在复杂化学体系中发现更多的化合物。

3.3 化合物确证

舒肝散为多组方中成药，成分复杂。本研究中首次采用UHPLC-Q-TOF-MS 法分析舒肝散中的主要成分，通过软件的质量数偏差、同位素分布匹配、分子式查找等功能，结合二级质谱数据库匹配及化合物裂解规律分析，鉴定出22种化合物及其相应结构，成分主要为黄酮类、酚酸类、萜类、有机酸类。其中，异甘草素和异鼠李素为黄酮类成分，异甘草素来源于方中甘草，异鼠李素来源于方中柴胡，具有抗炎、消食等药理作用［12-13］；阿魏酸及迷迭香酸为酚酸类成分，阿魏酸来源于方中当归，迷迭香酸来源于方中薄荷，具有抗血栓、抗病毒等药理作用［14-15］；栀子苷来源于栀子，具有缓解两胁疼痛、抗炎等药理作用［16］；芍药苷来源于白芍及牡丹皮，具有抗抑郁、调节免疫等药理作用［17］；茯苓酸来源于茯苓，具有缓解局部疼痛、减轻炎性反应、抗肿瘤等药理作用［18］；柠檬酸来源于方中多种药材，具有疏滞、健胃等药理作用。异甘草素、异鼠李素、阿魏酸、迷迭香酸等化合物均为首次在舒肝散中被鉴定出。相关化合物的确证为今后发掘、分析其药效物质奠定了基础，同时为今后提升舒肝散的质量标准提供了理论依据。本研究中还发现一些其他未知化合物的存在，其结构确证有待下一步研究。