一种基于MPPC的多通道PCR荧光检测系统

唐清泰

（ 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司，北京 102206 ）

0 引言

随着分子生物学技术的高速发展，核酸检测已经成为病原微生物鉴定的常用手段。PCR 实时荧光检测是实现核酸检测的关键技术，对荧光检测系统进行研究，特别是对多色、多通道以及多靶标检测模块进行开发可以达到提高仪器性能、扩大仪器适用范围的目的[1]。

该文在相关研究成果的基础上，以AXT-12 核酸提纯以及PCR 检测一体机（简称一体机）荧光扫描系统为研究对象，重点对系统的核心模块（4 通道（FAM、VIC、ROX以及CY5）荧光扫描头）进行研究，并对结构进行优化。

1 光学系统开发设计

1.1 应用背景

一体机荧光扫描系统结构如图1 所示。系统共有12 个热循环模块，每个模块上包括2 个反应管孔（放置PCR 反应管），12 个热循环模块放置在蛇形冷却水仓上面，水仓上包括进/出冷却水接头，在PCR 扩增的过程中，通过冷却水接头不断注入冷却液来实现快速热交换的功能。4 通道荧光扫描头放置在水仓的下方，在步进电机传动系统的带动下可以快速移动，以底部扫描的方式对反应管中发出的荧光信号进行检测。

图1 荧光扫描系统整体结构图

1.2 光路设计原理

光路设计是整个荧光扫描检测系统的关键部分，也是荧光扫描头的核心[2]，该部分的主要工作是通过单色LED光源将激发光汇聚到样品上，激发样品上的荧光素分子产生荧光，荧光信号通过汇聚光路汇聚到MPPC 上，以生成光电流，再通过AMP 转换电路生成可供A/D（16 位）进行采样的电信号。它主要包括激发光路和发射光路2 个部分，光学系统单通道光路结构如图2 所示。

图2 光学系统结构示意图

1.2.1 激发光路

激发光路由光源LED 发出的单色激发光经过平凸镜进行准直后，由激发光滤光片EXF 变为波长更窄的窄带激发光照射到二向色镜DM 上，二向色镜的功能是可以反射激发光、透射荧光，由二向色镜反射的激发光入射到激发平凸镜上，经激发平凸镜汇聚后聚焦到样品上，诱导荧光染料产生荧光。

1.2.2 发射光路

激发光诱导荧光染料产生的荧光经过激发平凸镜收集后变成平行荧光光束入射到二向色镜DM 上，经二向色镜DM 透射后入射到发射滤光片EMF 上，以滤除杂散光，滤除杂散光后的平行荧光经过发射平凸镜聚焦，形成荧光光斑，荧光光斑打在检测器MPPC 上，产生与该荧光强度匹配的电信号。

1.2.3 光路选型

一体机采用4 色4 通道（FAM、VIC、ROX 以及CY5）荧光扫描系统，根据扫描头的整体设计需求、各通道光路的设计指标和要求，激发/发射光路中各职能部件的选择将直接决定光学性能。职能部件主要包括LED、滤光片、二向色镜、探测器和凸镜等，各光学元件的重要指标类型及要求见表1。

表1 光学元件主要指标及性能控制

由于各通道荧光基团不同且存在斯托克斯位移[3]，因此各通道工作时所需最大激发光和发射光波长不同，发射光颜色也不同，见表2。

表2 通道光谱特性

由于各通道光谱特性的不同，所选用的LED 激发光源、激发滤光片、发射滤光片以及匹配的二向色镜也不同，因此各通道性能差异较大。各通道荧光基团所需激发匹配的单色光源，需要注意的是光源的强度，应避免亮度过大引起染料出现“光漂白”现象，可以过LED 串接限流电阻来调整亮度。

根据各通道光谱特性及光学元器件的控制指标要求，我公司联合深圳纳宏光电技术公司分别针对各通道定制了包括LED 激发光源在内的光学器件，具体包括激发滤光片、发射滤光片以及二向色镜等。

为了验证各通道所选光学器件的可行性，采用光谱仪分别对各通道的光谱特性进行测量，得到各通道的传输光谱曲线，如图3 所示。由图3 可知，各通道中通过激发滤光片的光基本被二向色镜完全反射，荧光的透射率基本也在50%以上，所选光学器件能够满足使用要求。

图3 FAM、VIC、ROX 以及CY5 通道光谱特性

探测器采用滨松MPPC（多像素光子计数器）S13360 系列，与传统的CCD、PD 或者PMT 不同，MPPC 表面贴装型号为3050PE（3050PE 的光学特性见表3）和3075PE，由于3050PE 的量子效率及灵敏度已经满足检测要求且它具有更优越的单位面积像素率、价格更低，因此推荐使用前者。

表3 MPPC 光学特性

可以通过光谱响应曲线（如图4 所示）查询S13360-3050PE 的光子灵敏度Sλ。由图4 可知，MPPC 的灵敏度与荧光波长有统计学意义，在可见光范围内，Sλ基本在8×104A/W以上。

图4 光谱响应曲线

该MPPC 的串扰概率P如图5 所示，当工作温度为25 ℃且VOP=VBR+3 时（VOP为工作电压；VBR为击穿电压），通过插补计算可知，串扰概率约为0.03。

图5 MPPC 串扰概率

MPPC 的暗电流如公式（1）所示。

式中：Id为MPPC 的暗电流；N为暗计数，N=0.5p.e（p.e为电荷脉冲）；M为增益；q为电荷电量，q=1.60×10-19C；P为串扰概率。

1.3 光路仿真

对选用的光学器件来说，在Code V 中进行建模，然后在Light Tools 中搭建光学系统模型，根据所选LED 的发光属性进行光线追迹，并对各通道进行分析和优化，单独对ROX通道的激发、发射光路进行追迹后的仿真模拟正视图如图6所示。由图6 可知，该通道的激发、发射光路准直度较强，荧光收集效率也比较高。用相同方法对其他通道光路的仿真也达到了相同的效果。

图6 ROX 通道仿真模型

1.4 灵敏度验证

该文主要使用传统方法来验证各通道的荧光收集效率和荧光激发能力。

荧光收集效率验证：各通道在最小分辨率下的荧光功率Fτ与灵敏度Sλ的乘积大于MPPC 的暗电流Id，即Fτ·Sλ>1.5Id，Fτ如公式（2）所示。以此证明，在激发光强度足够的情况下，系统能够探测到荧光信号。

式中：Fτ为入射在探测器光窗上的荧光功率；h为普朗克常数，h=6.6×10-34J·s；c为真空中光速，c=3.0×1017nm/s；n为单位面积荧光分子个数；η为平凸镜荧光收集效率，与透镜数值孔径NA有统计学意义；T为光路综合透过率，通常取50%；λ为发射荧光波长；τ为荧光的寿命。

荧光激发能力验证：根据比尔定律，在最小检测分辨率下，各通道荧光功率F与MPPC 灵敏度Sλ的乘积大于MPPC的暗电流，即F·Sλ>1.5Id，F如公式（3）所示。以此证明，荧光激发能力充足，系统能够检测到最小灵敏度下的荧光分子。

式中：K为仪器常数，与光学系统综合透过率和荧光收集效率有统计学意义；φ为量子产率，与荧光波长有统计学意义，各通道量子产率不同；I0为激发光强度（激发光辐射功率）；ε为分子吸收系数；c为样品浓度；l为试样光程。

通过计算和评估荧光激发能力和荧光收集效率再次证明了在激发光充足的情况下各通道理论上可以探测到荧光信号，并且能够检测到最小灵敏度下的荧光分子。后续的试验证明，各通道探测器MPPC 能够满足最小灵敏度为100 copies/mL 的检测需求。

2 光学机械设计

光学机械是光学系统的外围辅助设施，主要作用是固定、保护光学元件，协助实现光学性能，它保证整个光路及光路中各元件的密光性，同时保证各元件方便安装、固定牢靠。一体机扫描头在步进电机传动系统的带动下频繁加/减速、长距离连续移动，这就要求扫描头各光路零部件高度集成、体积小且质量轻。

多次优化后，一体机扫描头采用定制光学零部件，成功实现了4 通道小体积、轻量化集成的设计目标。集成后，各通道中心间距为8.6 mm，主要光学零部件最大光轴直径为6.0 mm，整体尺寸为36mm×23mm×18mm， 质量约为40 g，工作距离6 mm～8 mm 或者14 mm～19 mm。

结构设计是实现完整光学性能的关键因素，在方案阶段，应坚持在保证功能的前提下尽可能简单，降低因环节增多而带来失效风险的概率，同时须注意以下6 个方面：1）固定镜架和主体采用销钉定位、过孔调节以及螺钉紧固的原则。2） 镜片与固定机械间要设置弹性压紧结构，避免镜片受到冲击破裂。3） 做好密光处理，特别是LED 处和滤光片后的光路，避免激发光的交叉和对荧光信号的干扰。4） 远离热源，预防光学元件因热释而导致性能下降。5） 整体发黑处理，避免因零部件变形而导致光路扭曲。6） 组装后各部件密封线贴合部分用黑色密封胶填缝，避免外界杂散光的影响。

3 结语

设计多通道荧光检测系统的目的是保证PCR 能在多色、多靶标以及多样本应用下完成高精度、高稳定性和高重复性的工作。在开发AXT-12 一体机的过程中，利用MPPC 作为荧光的终端探测器是实时荧光定量PCR 检测的新尝试。对基于MPPC 探测器的4 通道荧光扫描头的关键核心——光学系统进行理论分析、设计选型、仿真和计算，从理论上保证扫描头的检测能力，使其能够正确解读“S”形曲线，避免误判。另外，对光学机械设计的讨论和总结可以避免盲目开发，提高效率，节约设计成本。随后的实况试验表明，基于MPPC 的一体机荧光扫描头的设计是合理的，荧光检测扫描系统也达到了预期要求。