基于网络药理学和分子对接分析的“金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤的作用机制研究

郭 佳，方胡凤，苏 丹，杨 浩

（1．天津市中医药研究院附属医院，天津 300120； 2.南京医科大学附属常州第二人民医院，常州 213000）

临床中急性肾损伤是一个长期被关注的问题，主要表现为肾小管坏死、肾小球血流动力学改变、肾小球血浆流量和超滤系数降低等症状［1］。据统计发现，在我国急性肾损伤中，因药物引起的急性肾损伤病例占比在过去10 年从26.5%上升到42.9%，已造成严重的医疗负担［2］。同时，药物诱导急性肾损伤也成为药物研发失败和药品撤市的最常见原因之一［3］。据报道［4］，多种药物均可导致急性肾损伤，包括抗癌药物（顺铂）、氨基糖苷类（庆大霉素、卡那霉素、链霉素或妥布霉素）、两性霉素B、抗病毒药物（阿德福韦、西多福韦或替诺福韦）、放射对比剂、双磷酸盐等。尽管急性肾损伤的血液净化治疗和化学药物治疗手段在不断进步，但其发病率和病死率仍然很高，如何有效缓解药源性急性肾损伤越来越受到临床医师们的关注。

随中医药现代化进程的推进，转向传统医学中寻找可替代的药物治疗越来越受到重视。药源性急性肾损伤在疾病早期常表现肾失开阖，湿热、浊毒内生，上犯中焦，脾胃升降、运化功能失常。中医基本治法主要为清热解毒、通腑泄浊、活血化瘀［5］。“金银花-连翘”药对是治疗温病最常用的药对之一，根据中医配伍理论，二者配伍属于七情配伍中的相须，即二者配伍可以增强清热解毒、疏风散热之功效［6］。临床上，中医师善用“金银花-连翘”药对缓解早期药源性急性肾损伤：如刘旭生教授巧用“金银花-连翘”药对结合半夏泻心汤与解毒活血汤，缓解患者因乙酰唑胺导致的急性肾损伤，疗效显著［5］；吕承全老中医重用金银花、连翘蒲公英等清热解毒药治疗热毒炽盛、肾失开阖型急性肾衰［7］。整体观念和辨证论治是中医特色所在，用药遵循多成分、多靶点、多途径调节的理念［8］。而如何科学地阐释“金银花-连翘”配伍治疗早期药源性急性肾损伤中的成分-靶点-疾病之间关系，仍有待进一步研究。

网络药理学是基于系统生物学理论，强调对某种通路的多途径调节，通过构建各成分间网络来分析其相互作用，关注网络中的关键节点，可系统阐述中药及复方的物质基础及分子机制［9］。这与中医学整体观念、辨证论治的角度去诊治疾病的理论、中药及其方剂的多成分、多途径、多靶点协同作用特点相吻合［10］。网络药理学也因此成为系统性分析中药复方多靶点、多通路作用机制的有效工具。因此，本研究拟基于网络药理学研究方法，筛选出“金银花-连翘”药对治疗早期药物诱导急性肾损伤的活性成分，预测其关键靶点和可能作用通路，以期为临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 “金银花-连翘”药对活性成分的筛选和靶点预测 利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索金银花和连翘的全部化学成分，依据药物代谢动力学（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME） 参数筛选口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18 的活性化合物。运用TCMSP 靶点预测模块对筛选的活性成分作用靶点进行预测。并利用Uniprot（https：//www.uniprot.org）将所得到的靶点进行统一规范处理。

1.2 “金银花-连翘”药对“活性成分-靶点”网络的构建 通过软件Cytoscape 3.7.2（https：//www.bootcdn.cn/cytoscape/3.7.2）构建“金银花-连翘”药对“活性成分-靶点”网络，其中，使用“节点”（node）表示成分或靶点，用“边”（edge）表示二者之间的关系；采用软件内置Network Analyzer 分析工具分析网络特征，包括连接度（degree）、介度（betweenness） 及紧密度（closenesss）等，研究“金银花-连翘”药对中活性成分与靶点及其之间的关系。

1.3 药物诱导急性肾损伤相关靶点的收集 以“drug induced acute kidney injury”为关键词，在Genecards（https：//www.genecards.org）、OMIM（https：//omim.org）等疾病数据库进行检索。在Genecards 数据库中，Score 值越高则代表该靶点与疾病联系密切。根据经验，若靶点过多则设定Score 大于中位数的目标靶点为肾损伤的潜在靶点，合并2 个疾病数据库靶点后，删除重复值得到药物诱导急性肾损伤相关靶点。

1.4 韦恩图的绘制以及靶点相互作用网络（PPI）的构建 为获得“金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤的潜在作用靶点，通过Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）软件获得疾病靶点与药物靶点的交集，并绘制韦恩图进行比较。为明确“金银花-连翘”药对的潜在治疗药物诱导急性肾损伤作用靶点以及靶点之间的相互作用，将交集靶点导入STRING 11.5（https：//cn.string-db.org）数据库构建蛋白相互作用网络模型即PPI 网络模型，将生物种类设定为“Homo sapiens”，其余设置均为默认设置，得到PPI 网络，并通过Cytoscape 3.7.2 软件内置Network Analyzer 工具分析PPI 网络特征，判断“金银花-连翘”药对与疾病关联紧密的核心靶点。

1.5 通路富集分析 将“金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤的靶点录入Metascape 平台（http：//metascape.org/gp/index.html），设置P＜0.01，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，保存数据结果并采用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）对数据进行可视化处理。

1.6 “金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤的成分-靶点-信号通路网络构建 分析KEGG 通路富集结果，收集与疾病相关的通路，选取排名前20 通路上的靶标，并将这些靶标与相应的活性成分对应，通过Cytoscape 3.7.2 软件绘制“活性成分-靶点-信号通路”网络关系图。

1.7 “金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤的主要活性成分和潜在作用靶标蛋白分子对接验证 选取“金银花-连翘”药对活性成分-靶点网络图中度值排名靠前的活性成分和作用靶标PPI 网络中核心基因进行分子对接。从TCMSP 和RCSB PDB 数据库（https：//www.rcsb.org）分别获取“金银花-连翘”药对化学成分的分子结构和靶标蛋白分子结构，通过SYBYL-X 2.0 软件（Tripos Inc.，St. Louis，MO）进行分子对接，并将对接得分较高的化合物与靶标蛋白进行可视化分析。

2 结果

2.1 “金银花-连翘”药对活性成分及靶点获取 从TCMSP 数据库中初步获取金银花成分236 种，连翘化学成分150 种，经ADME 筛选以及剔除未查询到靶点的成分，最终获得金银花活性成分17 种，连翘活性成分19 种，两者共有成分4 种（见表1）。金银花有效成分作用靶点基因204 个，连翘有效成分靶点基因217 个，合并后删除重复值共获得靶点基因230 个。

2.2 “金银花-连翘”药对“活性成分-靶点”网络的构建及分析 采用Cytoscape3.7.2 对“金银花-连翘”活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制（见图1），网络中共有264 个节点（其中包含32 个活性成分、230 个靶点和2 个药物）与916 条关系。图中节点的大小代表相应的度值，节点面积越大代表度值越大，表示涉及的生物功能越多，其生物学重要性越高。其中依据度值排序，排序靠前的主要为槲皮素（D）、山柰酚（B）、木犀草素（C）、β-谷甾醇（A）、汉黄芩素（LQ1）、豆甾醇（JYH13）等。

2.3 药物诱导急性肾损伤相关靶点的获取 检索Genecards 数据库，得到疾病靶点7 011 个，根据相关性分数中位数多次筛选，最终筛选出相关性分数＞18 的靶点作为药物诱导急性肾损伤潜在靶点。检索OMIM数据库，获得疾病相关靶点392 个。合并两个数据库疾病靶点，删除重复值，最终获得1 400 个疾病靶点。

2.4 韦恩图的绘制以及靶点相互作用网络（PPI）的构建 将筛选的“金银花-连翘”药对活性成分靶点与药物诱导急性肾损伤疾病靶点取交集，通过Venny 2.1.0绘制韦恩图（见图2），得到交集靶点151 个。将交集靶点提交到STRING 11.5 平台，将生物种类设定为“Homo sapiens”，其余设置均为默认设置，得到PPI 网络（见图3），并通过Cytoscape 3.7.2 软件内置Network Analyzer 工具，根据靶点度值中位数多次筛选，最后筛选出度值大于83 的核心蛋白共21 个，包括：AKT1、TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、ESR1、EGFR、IL1B、CTNNB1、MYC、HIF1A、EGF、PTGS2、CCND1、MMP9、PTEN、FOS、FN1、PPARG（见图4），说明这些靶点在缓解药源性急性肾损伤中发挥重要的作用。

表1 “金银花-连翘”药对活性成分

图1 “金银花-连翘”药对活性成分-靶点网络图

图2 “金银花-连翘”药对-药物诱导急性肾损伤疾病靶点韦恩图

图3 “金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤的靶点PPI 网络

图4 核心靶点PPI 网络图

2.5 靶点功能与通路的富集分析 利用Metascape平台对上述151 个关键靶点进行基因富集分析，包括GO 的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）分析。生成结果按P 值从小到大排序，选取前20条利用微生信平台对数据进行可视化，见图5A、5B、5C，表明“金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤主要涉及的生物过程有对外源生物刺激的反应、凋亡信号通路、对氧响应、损伤响应、生长因子响应、细胞成分运动及细胞黏附等。同样地，KEGG 富集分析中，选取与药物诱导急性肾损伤相关的前20 条进行可视化分析，其中，“金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤主要参与的信号通路包括：磷脂酰肌醇3 激酶-AKT 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）、IL-17 信 号 通 路、细 胞 凋 亡（Apoptosis）、p53 信号通路（p53 signaling pathway）、低氧诱导因子-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）、Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路（Jak-STAT signaling pathway）等，见图5D。

2.6 “金银花-连翘”药对活性成分-靶点-信号通路网络构建 采用Cytoscape 3.7.2 软件构建“金银花-连翘”药对“活性成分-靶点-信号通路”网络（见图6）。结果显示，“金银花-连翘”药对通过29 个关键活性成分，作用于121 个潜在靶点，调控20 条不同的药物诱导急性肾损伤信号通路，体现了中药多成分、多靶点、多通路治疗药物诱导急性肾损伤的作用机制。

2.7 分子对接 在PPI 网络中，治疗药物诱导急性肾损伤的关键靶点蛋白主要有AKT1、TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、ESR1，将其分别与6 个主要活性成分槲皮素（D）、山柰酚（B）、木犀草素（C）、β-谷甾醇（A）、汉黄芩素（LQ1）、豆甾醇（JYH13）进行分子对接，对接结果见表2。通常Total-Score 得分大于4.25 的结果被认为具有对接活性，得分越高活性越强。将Total-Score 对接得分，使用微生信平台绘制热图，结果见图7。可以看出，CASP3 与6 种主要成分的对接活性都表现出一定优势，VEGF 与山柰酚、β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇也表现出较高活性，IL6、ESR1、JUN、TP53 与山柰酚和槲皮素的对接活性均较高。将其中对接得分大于5.7 的最佳构象使用SYBYL-X 2.0 软件可视化，结果见图8。

图5 “金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤的GO 功能及KEGG 通路富集分析

图6 “金银花-连翘”药对治疗药物诱导急性肾损伤活性成分-靶点-信号通路图

表2 “金银花-连翘”药对主要活性成分与靶标蛋白分子对接得分

图7 分子对接结果得分计算热图

图8 关键靶基因与“金银花-连翘”药对主要活性成分对接模式图

3 讨论

中医古籍中很早就有关于急性肾损伤的记载，根据其少尿或无尿、恶心呕吐、水肿等急骤而突出的症状，归在“癃闭”“关格”“水胖”“溺毒”“肾风”等疾病范畴内［11］。根据中医病因病机及疾病的发展，外邪侵袭脏腑，导致肺、脾、肾之功能异常，肺之治节无权，脾之健运失司，肾之开阖无度，加之膀胱气化功能失常，水湿浊邪不能排出体外，从而发为本病［12］，药源性急性肾损伤在初期往往以邪实为主，正虚为次，治疗上以祛邪为主，佐以扶正，以清热解毒、通腑化浊、活血化瘀为基本法则［13］。“金银花-连翘”为中医临床清热解毒常用药对，《本草新编》记载金银花“无经不入，而其专入之经，尤在肾、胃二经”，“欲既消胃毒，而又消肾毒之药，舍金银花，实无第二品也”；连翘为升科要药，“化毒必须用金银花，连翘以为佐使，则攻邪有力，又未必无小补也”。两者常相须为用，既有清凉透泻、清热解毒的作用，又有芳香避秽的功效，在透解卫气分邪毒的同时，兼顾了温热病邪多挟秽浊之气的特点［14］。

本研究利用网络药理学方法，共收集了“金银花-连翘”药对活性成分32 种，基于对“金银花-连翘”药对活性成分-靶点网络的分析，度值排列靠前的成分主要有槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、汉黄芩素等，表明这些成分可能是“金银花-连翘”药对药理活性主要成分。缓解急性肾损伤相关研究基础表明，槲皮素可通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路保护脂多糖诱导的小鼠急性肾损伤［15］。山柰酚可下调炎症蛋白HMGB1、TLR4 和P2X7 受体，对急性肾损伤具有显著的保护作用［16］。木犀草素可通过降低肾中炎症和凋亡因子［17］、调节p53 依赖的凋亡通路［18］、Kim-1/NF-kappa B/Nrf2 信号通路［19］等多种途径改善药物诱导急性肾损伤。β-谷甾醇能上调超氧化物歧化酶和谷胱甘肽活性，使丙二醛水平降低，同时下调肿瘤坏死因子α 和白细胞介素-6 水平，上调内皮型一氧化氮合酶水平，通过限制炎症反应和氧化应激治疗急性肾损伤［20］。汉黄芩素可靶向调节ripk1 介导的坏死［21］，通过影响PPAR-γ、炎症、凋亡和Wnt/β-catenin 通路［22］等多种途径缓解顺铂诱导的急性肾损伤。

通过对交集靶点的PPI 网络进行分析，以度值中位数为卡值，筛选出21 个核心靶点，其中度值较大的AKT1、TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、ESR1 等靶蛋白可能是“金银花-连翘”药对缓解药物诱导急性肾损伤的关键作用靶点。AKT 又称为蛋白激酶B，在细胞自噬中起到重要作用，自噬是一种维持细胞内稳态的动态分解代谢过程，与急性肾损伤的发病机制密切相关，研究发现AKT 可通过参与PI3K/Akt 信号通路调节细胞自噬能力，从而缓解顺铂引起的急性肾损伤［23］。同时TP53 蛋白也在调节自噬方面发挥重要作用［24］。炎症反应是药物所致急性肾损伤的特征性病理改变之一［25］，龚琴等［26］通过4 种药物诱导动物产生急性肾损伤，并观察比较了肾脏相关炎性坏死因子表达的变化，结果发现IL6、TNF、CASP3 蛋白明显上调，采取措施抑制3 种蛋白表达后，可明显缓解药源性急性肾损伤，说明IL6、TNF、CASP3 蛋白可调节和控制炎症反应，在肾损伤修复中发挥一定的作用。VEGFA 是一种内皮生长因子及血管通透性的调节因子，目前已被证实是一种具有肾脏保护功能因子［27］。JUN 是MAPK 信号通路的重要成员，在细胞增殖、分化、存活和凋亡过程中发挥重要作用，与急性肾损伤病程的发展密切相关，目前已有研究发现JUN 可参与JNK/CJUN 途径调节庆大霉素诱导的肾损伤［28］。有研究表明［29］由ESR 主导的雌激素受体信号通路在维持线粒体稳态中起着至关重要的作用，雌激素可通过受体参与肾脏的修复与再生，ESR1 基因的多态性也与肾脏疾病的易感性和预后有关。

通过生物富集分析可知，生物学进程包括外源生物刺激的反应、对氧响应、损伤响应、生长因子响应、凋亡信号通路、细胞成分运动及细胞黏附等，主要涉及激酶结合、磷酸酶结合、氧化还原酶活性、细胞因子受体结合等方面的功能。经KEGG 富集分析可推断，“金银花-连翘”缓解药物诱导急性肾损伤的信号通路主要与凋亡、氧化应激、血管生成、炎症反应相关，如细胞凋亡信号通路、MAPK 信号通路、p53 信号通路、血管内皮生长因子信号通路、HIF-1 信号通路等。顺铂诱导的急性肾损伤涉及多种细胞凋亡途径，肾毒性的发生与Caspase 依赖性和非依赖性途径诱导细胞凋亡有关［30］。高欢［31］通过凋亡通路相关蛋白的表达情况，证实了药物干预抑制Caspase-3 的剪切和活化，降低促凋亡蛋白Bax 的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，可有效减轻顺铂对于HK-2 细胞的细胞毒作用，改善细胞形态，提高细胞活力。研究［32］表明，MAPK 家族成员细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、p38MAPK 与庆大霉素、顺铂等具有肾脏毒性药物引起的AKI 关系密切，抑制p38MAPK 和ERK1/2 的表达，可有效改善炎症反应以及降低氧化应激损伤。p53是一种肿瘤抑制基因，通过转录激活参与细胞周期和细胞凋亡等过程，近年研究发现p53 在急性肾损伤的损伤和修复中发挥重要作用：龙泓伶等［33］总结发现，p53 是加重急性肾损伤的重要因素，主要通过调节细胞自噬、促进细胞凋亡、加重细胞周期组织等方式促进急性肾损伤的进展，冯娟等［34］证明，抑制p53 的表达，可减轻顺铂治疗乳腺癌引起的急性肾损伤。血管内皮生长因子（VEGFA）是机体内血管生成过程中的必不可少的调控因子，并且在肾小球的发育以及维持肾小球稳态方面都起着重要作用［35］。VEGFA 作为VEGF家族的重要一员，已经被发现在肾脏血管网系统的形成和发育阶段发挥关键性作用［36］。同时VEGFA 也是HIF 的一个靶基因，HIF-1α 在多种诱因诱发的急性肾损伤中对肾组织起到保护作用，缺血预处理后高表达的HIF-1α 可能通过促进血管内皮生长因子VEGF和葡萄糖转运蛋白Glut-1 的表达，促进肾脏缺血后微循环的重建，改善缺氧细胞的氧利用障碍，提高肾小管上皮细胞的氧供和能量代谢，增强耐缺血缺氧能力，为肾脏结构和功能的维持创造条件［37］。综上所述，与修复肾损伤相关的通路主要与免疫反应、炎症反应、凋亡、氧化应激有关，因此推测“金银花-连翘”可能通过细胞凋亡信号通路、MAPK 信号通路、p53 信号通路、血管内皮生长因子信号通路、HIF-1 信号通路等干预药源性急性肾损伤。

分子对接结果显示CASP3 与多个核心成分均具有对接活性，特别是槲皮素、β-谷甾醇、汉黄芩素与CASP3 的对接得分均大于6，表现出更强的对接活性。除此之外，对接得分大于6 的还有VEGF 与山柰酚的对接。这提示“金银花-连翘”药对缓解药物诱导急性肾损伤的可能机制是通过槲皮素、β-谷甾醇、汉黄芩素、山柰酚等活性成分，结合CASP3、VEGF 等靶点通过调控细胞凋亡、炎症反应、血管生成等相关通路，促进损伤肾细胞的修复与生长。进一步验证了网络药理学所得出的结果。

4 结语

本研究采用网络药理学方法从系统层面分析了“金银花-连翘”药对与药物诱导急性肾损伤的关系，筛选出药对活性成分32 种，活性成分缓解药源性急性肾损伤的核心靶点21 个。运用生物富集与分子对接，初步预测了药对干预药源性急性肾损伤的可能作用机制：通过槲皮素、β-谷甾醇、汉黄芩素、山柰酚等活性成分，结合CASP3、VEGF 等靶点调控细胞凋亡、炎症反应、血管生成等相关通路，促进损伤肾细胞的修复。本研究为今后进一步从分子生物学验证和更深入阐述其药理作用机制提供了思路和依据。