苯妥英抑制心脏Cav1.2通道合成与转运的机制研究

罗超迪,闫 炀,郑幸龙,韩 丹

抗癫痫药物苯妥英(phenytoin,PHT)是一种ⅠB类抗心律失常药物,主要作用于心肌细胞的电压依赖性钠离子通道(Nav1.5)[1]。苯妥英用作抗心律失常药物的典型剂量为每天200～400 mg,目标血药浓度为40～70 μmol/L[2]。然而,苯妥英引起的一些严重心脏不良反应已有报道,特别是在心律失常方面,包括心动过缓、窦性停搏、Ⅰ型Brugada型心电图模式和心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)[3-6]。体外研究表明,苯妥英引起的心律失常可能是由于其阻断了快速激活的延迟整流钾(IKr)通道而引起的[7]。苯妥英通过阻断IKr通道导致心脏复极时间延长,进而导致QT间期延长,早期后除极(early after depolarization,EAD)、延迟后除极(delayed after depolarization,DAD)和触发活动,增加了室性复极的透壁分散,最终导致尖端扭转型室性心动过速(torsades de pointes,TdP)甚至心室颤动(ventricular fibrillation,VF)[8]。

钙电流是由广泛分布于心脏组织的L型钙通道(Cav1.2)介导的,该通道在心脏组织中发挥重要的生理作用。心脏Cav1.2通道参与触发兴奋-收缩耦联(excitation-contraction coupling,EC),控制动作电位时程(action potential duration,APD)并且调节基因表达[9]。研究表明,当内向电流增加和/或外向电流减少时会发生EADs,导致心脏APD延长,其中钙离子(Ca2+)内流发挥重要作用,在这种条件下,动作电位平台期Cav 1.2通道可能重新激活并反向复极化[10]。研究还表明,细胞内Ca2+循环,特别是自发Ca2+释放是导致EADs的原因之一[11]。

Cav1.2通道在心脏的起搏、心率、心律和收缩活动中发挥着关键作用[12]。苯妥英诱发的心律失常可能与其干扰心脏Cav1.2通道有关。苯妥英对胰高血糖素分泌肿瘤细胞中的Cav1.2通道的影响已有研究,但苯妥英对心肌细胞(CMs)中Cav1.2通道的作用机制尚不清楚[13]。本研究采用CellTiter-Glo法探讨苯妥英对CMs活性的影响,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)和激光扫描共聚焦显微镜探讨苯妥英对SD大鼠CMs中Cav1.2通道的合成和转运的影响。

1 材料与方法

1.1 心肌原代细胞提取 无特定病原体(SPF)级雄性Sprague-Dawley(SD)乳鼠(1～3 d,购于西安交通大学医学部动物实验中心)10只,乙醇消毒后将心脏剪下并将心室肌组织剪碎成约1 mm3组织块,在不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)(Hyclone)中冲洗2次,向组织块中加入2 mL胰蛋白酶(索莱宝,T1300)和Ⅱ型胶原酶(索莱宝,C8150),37 ℃水浴锅中轻微震荡,取出上清,并在上清中加入含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素(Hyclone)的DMEM/F-12培养基(Corning),重复7次,前4次每次振荡5 min,后3次每次振荡7 min。用铁筛将消化后的液体过滤,将收集到的液体以800 r/min离心5 min。弃上清液,然后用DMEM-F12完全培养基重悬细胞并培养。培养45 min后,心肌成纤维细胞贴壁,取上清液,同时在上清液中加入抑制剂,上清液即为原代心肌细胞。

1.2 苯妥英配制 苯妥英(S2525,Selleck)溶解于二甲基亚砜(DMSO)(碧云天,ST038)中,储存液浓度为20 mg/mL,-20 ℃保存,每次实验前用生理盐水连续稀释至最终使用浓度。实验过程中DMSO的最终含量不超过0.05%。

1.3 细胞干预及CellTiter-Glo法测定细胞活力 CellTiter-Glo法是基于ATP检测的快速细胞活力检测法[14]。将原代CMs接种于96孔板(100 μL,5×104个/mL细胞,5 000个/孔细胞),待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12 h后,分别使用含0 μg/mL、0.000 1 μg/mL、0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、100 μg/mL苯妥英的完全培养基干预细胞并进行分组,然后在37 ℃、5%CO2环境中分别孵育24 h和48 h(1 μg/mL苯妥英≈3.96 μmol/L苯妥英)。每孔加入CellTiter-Glo试剂和DMEM(Corning)各50 μmol/L,在避光条件下于培养箱中孵育10 min。使用Tecan Infinite M1000酶标仪(Tecan Austria GmbH,Grödig,Austria)记录结果。重复该实验至少3遍至结果保持稳定。

1.4 Western Blot测定Cav1.2蛋白水平 将原代CMs(n=1 250)接种于直径35 mm的培养皿(中国香港NEST Biotechnology公司)内,待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12 h后,分别使用含0 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL苯妥英的完全培养基干预细胞48 h后提取蛋白。每1 mL蛋白裂解液RIPA(碧云天,P0013B)中加入20 μL(50×)蛋白酶抑制剂储存液(碧云天,P1005),使抑制剂的最终浓度为1 mmol/L。吸去上清液后,用PBS清洗培养皿3次,加入100 μL蛋白裂解液,在冰上用细胞刮刀轻刮细胞,每次5min,3次后将液体转移至1 mL EP 管中,冰上孵育30 min,旋涡振荡3次,于4 ℃,半径12 cm,12 000 r/min离心30 min,将上清液转移至干净EP管内,用蛋白定量试剂盒(中晖赫彩,PQ003)测定各组样本蛋白质浓度,分装后置于-80 ℃冰箱保存。取蛋白样品40 g进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移至硝酸纤维膜(碧云天,FFP39),室温下使用50 g/L牛血清清蛋白的TBST封闭硝酸纤维膜2 h,再加入羊抗鼠Cav1.2抗体(Abcam,ab58552)中4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(博奥森,bs-80295G-HRP)孵育1 h,将膜用TBST缓冲液洗涤3次后加入超敏化学发光试剂(碧云天,P0018FS),曝光、成像。用Quantity One分析软件测定各条带灰度值,结果用目的条带的灰度值/β-actin条带的灰度值表示。

1.5 Cav1.2蛋白的表达定位 将原代CMs(1 250个)接种于直径35 mm的培养皿(香港NEST Biotechnology公司)内,待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12 h后,分别使用含0 μg/mL和10 μg/mL苯妥英的完全培养基干预细胞48 h后连续孵育抗CACNA1C抗体(Abcam,ab58552),抗Calnexin抗体(Invitrogen,MA3-027),Hoechest(Sangon,E607329)。洗涤后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Invitrogen,1832035)孵育,细胞图像采用FV1000激光扫描显微镜(德国Leica,DM2500)获取。

2 结 果

2.1 CellTiter-Glo法检测苯妥英对细胞活力的影响 随着苯妥英浓度的增加,除100 μg/mL组在干预48 h时的细胞存活率降低到85.23%(P<0.05)外,其余各组间细胞存活率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图1。

2.2 Western Blot检测苯妥英对Cav1.2蛋白合成的影响 根据CellTiter-Glo实验和前期实验结果[7],本研究选择了不同浓度的苯妥英(0 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL)干预原代CMs 48 h后提取细胞蛋白。采用Western Blot评价不同浓度苯妥英对原代CMs中Cav1.2通道蛋白合成的影响。结果显示,100 μg/mL苯妥英组明显降低了原代CMs中Cav1.2蛋白的合成,与0 μg/mL组细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)(见图2、图3)。因此,认为苯妥英在超过治疗水平的较高浓度下可能导致Cav1.2通道蛋白合成异常。

图2 Cav1.2及β-actin蛋白免疫印迹

与0 μg/mL苯妥英组比较,＊ P<0.05。图3 Cav1.2蛋白表达定量图

2.3 激光扫描共聚焦显微镜观察苯妥英对Cav1.2蛋白转运的影响 为确定苯妥英对Cav1.2蛋白转运的影响,使用激光扫描共聚焦显微镜评估0 μg/mL和10 μg/mL苯妥英干预组原代CMs染色图像(见图4),对照组抗CACNA1C抗体荧光(红色)主要出现在细胞表面,表明Cav1.2蛋白从内质网正常转运到细胞膜。然而,10 μg/mL干预组细胞图像显示,Cav1.2通道蛋白从内质网转运至细胞膜受阻,红色荧光从膜上消失,Calnexin是内质网膜上作为分子伴侣参与新生肽链的折叠、加工的蛋白质,抗Calnexin抗体荧光(绿色)集中分布在内质网膜上,说明10 μg/mL苯妥英干预后Cav1.2 蛋白由内质网转运至细胞膜受阻。尽管苯妥英在100 μg/mL水平开始抑制Cav1.2通道蛋白的合成,但在治疗剂量范围内可诱导蛋白转运功能障碍。以上结果表明,苯妥英易导致Cav1.2通道蛋白转运异常。

图4 原代CMs亚细胞水平Cav1.2蛋白定位图像(A、B、C、D为无苯妥英干预的原代CMs的图像,E、F、G、H为10 μg/mL苯妥英干预的原代CMs的图像。蓝色标记细胞核,绿色标记Calnexin,红色标记Cav1.2)

3 讨 论

苯妥英于1938年作为一种抗癫痫药物引入临床,后来又作为抗心律失常药物被用于心血管领域[15]。近年来,心电生理领域对苯妥英不良反应的认识逐渐深入。苯妥英的致心律失常作用是由于其阻断了心肌细胞离子通道,其中Cav1.2通道在调节心率和心律方面发挥重要作用[16]。本研究评估了苯妥英对原代CMs中Cav1.2蛋白合成和转运的影响,结果显示,苯妥英对心脏Cav1.2通道蛋白表达的抑制具有浓度依赖性;Western Blot显示,100 μg/mL苯妥英导致Cav1.2通道蛋白合成显著降低;苯妥英干预后的细胞荧光照片显示,Cav1.2通道蛋白从内质网转运到细胞膜表面的过程出现异常。苯妥英虽然仅在大于治疗剂量上抑制了Cav1.2的合成,但仍可在治疗剂量范围内诱导蛋白转运功能障碍,这或许可以部分解释苯妥英的致心律失常作用;也有可能是由于苯妥英对Nav1.5通道的抑制作用使Na+电流降低,抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinasesⅡ,CaMKⅡ)的活性,进而导致Cav1.2通道蛋白表达降低。因此,苯妥英对CMs Cav1.2蛋白的影响也可通过Na+和Ca2+阻滞剂干预进一步探究。

Abrahamsson等[17]研究发现,较低水平的苯妥英导致心动过缓,而随着苯妥英浓度的增加,逐渐出现室性心律失常、其他严重的心脏不良反应,如致命性室性心律失常,Ⅰ型Brugada型心电图、低血压、窦性停搏和SCD也有报道[5-6,18]。苯妥英抑制Cav1.2蛋白的合成和转运,可能导致Ca2+电流降低,从而导致内质网偶联功能障碍,从而阻碍相邻心肌细胞电活动的传导。随着Ca2+电流的降低,IKr相对增加,促进APD明显缩短,心室复极跨壁离散度增加,导致ST段抬高,J波形成,甚至“R on T”,最终导致心室颤动[19-20]。这些级联反应在一定程度上可以解释苯妥英引起的心律失常。另有研究显示,苯妥英成功纠正了用传统治疗方法难以纠正的TdP病人的心律失常[21-22]。苯妥英的抗心律失常作用包括降低心室自律性、交感放电和增加房室传导速度[21]。

由于苯妥英对Cav1.2通道的抑制作用,本研究结果显示,苯妥英在不同的个体中表现出促心律失常作用或抗心律失常作用。因此,苯妥英的用药是一把双刃剑,在选择用药中应综合评价苯妥英的个体风险获益比,以减少不良反应的发生。

综上所述,本研究验证了苯妥英对心脏Cav1.2通道的影响,苯妥英以浓度依赖性的方式抑制Cav1.2通道,改变Cav1.2蛋白合成并干扰通道蛋白运输,这可能是苯妥英促心律失常作用的原因。