基于网络药理学和分子对接探讨养心氏片抗心肌纤维化的作用机制

陈滢如,路士华,王 震,程 艳

心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是以在正常心肌组织中的细胞增殖、细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)过度堆积为主要表现的疾病。心肌纤维化破坏心肌结构进而导致心肌紊乱,引起心脏电、机械和血管舒缩功能的不良变化,还可加剧心脏疾病事件的发生率[1]。目前心血管疾病仍是全球最常见的死亡原因[2],冠心病、主动脉瓣狭窄和高血压是心肌纤维化最常见的病因[3],心肌纤维化可出现在多种心脏疾病的过程中[4]。西医主要以血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、醛固酮拮抗剂、β受体阻滞剂、他汀类等药物治疗。心肌纤维化属于中医学“心悸”“胸痹”“怔忡”等范畴,中药复方具有多成分、多靶点、多途径的治疗特点。

养心氏片为周次清教授的临床经验方,由黄芪、人参、丹参、延胡索、山楂、党参、灵芝、葛根、当归、淫羊藿、地黄、黄连、炙甘草13味药物组成,具有益气活血、行脉止痛之效。研究表明,养心氏片具有改善血流动力学、保护心肌、调节代谢、抗动脉粥样硬化、改善抑郁等作用,广泛应用于冠心病的临床治疗且效果显著[5],但是作用于心肌纤维化的机制研究较少。本研究通过网络药理学探讨养心氏片治疗心肌纤维化的潜在作用机制,并利用分子对接技术对养心氏片的有效活性成分和受体蛋白分子进行虚拟结合,以挖掘其作用靶点和结合位点。

1 资料与方法

1.1 养心氏片活性成分检索及相关靶点筛选 通过中医药系统药理学平台(TCMSP,https://tcmspw.com)检索黄芪、党参、丹参、葛根、淫羊藿、山楂、地黄、当归、黄连、延胡索、灵芝、人参、甘草13味中药的活性成分,由于中药进入体内多通过有效成分入血发挥作用,故根据口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且类药性(drug-likeness,DL)≥0.18对活性成分信息进行初步筛选[6],以获得活性成分及作用靶点,根据文献报道补充预测到的活性成分的已知靶点。在Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)对活性成分作用靶点进行统一规范。

1.2 心肌纤维化相关靶点筛选 运用基因名片数据库(GeneCards,https://www.genecards.org)、药物遗传学与药物基因组学知识库(PharmGKB,Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM,http://omim.org)、DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)及治疗靶点数据库(TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)分别以“cardiac fibrosis”或“myocardial fibrosis”为关键词检索获得心肌纤维化相关靶点。

1.3 蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建 将养心氏片的活性成分靶点和疾病靶点上传至Venny图网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集作为养心氏片抗心肌纤维化的共有靶点,获得交集靶点,利用 Cytoscape 3.8.0 软件进行可视化分析。

1.4 养心氏片“药物-活性成分-靶点”网格构建 通过软件Cytoscape 3.8.0进行养心氏片“药物-活性成分-靶点”网络构建和分析。图中以“节点”表示药物,以“边”表示活性成分与靶点之间的关系。

1.5 基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 利用R语言软件通过GO和KEGG对核心靶点进行生物学过程及作用通路分析,并将结果以条形图、气泡图形式呈现。

1.6 关键靶点的分子对接验证 选取PPI网络中度值(Degree)较高的靶点,在PDB数据库获取靶蛋白及配体结构,利用Pymol软件对蛋白进行脱水,清除配体,再将处理好的蛋白利用AutoDock vina软件进行加清等操作后转为＊pdbqt格式,进行分子对接并计算最低结合效能,评价养心氏片主要活性成分与核心靶点的结合活性。

2 结 果

2.1 养心氏片活性成分及靶点 通过筛选并去除重复成分后获得符合条件的活性化合物269个、中药预测靶点4 787个。养心氏片各中药化学成分及预测靶点信息见表1。

表1 养心氏片各中药化学成分及预测靶点信息

2.2 心肌纤维化相关靶点 将GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank、TTD数据库中获得的心肌纤维化疾病相关靶点合并,并剔除重复项,最终获得候选疾病靶点5 537个。将疾病靶点与活性成分靶点取交集获得224个重复基因,运用Venny 2.1制作韦恩图(见图1)。

图1 养心氏片中药活性成分与心肌纤维化基因数据库韦恩图

2.3 PPI网络分析 将224个疾病与活性成分靶点导入STRING 11.0数据库中,将数据初步筛选后导入Cytoscape 3.8.0软件中构建PPI网络。详见图2、图3。

图2 心肌纤维化与中药活性成分靶点交集图

图3 心肌纤维化与中药活性成分靶点交集PPI网络图

2.4 “药物-活性成分-靶点”网络图分析 将养心氏片中13味中药的有效成分整理编号,并筛选出共有成分,统一编号如“MOL000392=A1”,并将整理好的活性成分和靶点导入Cytoscape 3.8.0软件中,构建“药物-活性成分-靶点”网络图(见图4),图中包括521个节点和5 086条边,通过Cytoscape 3.8.0软件中“Network Analyzer”的功能计算出不同节点的Degree值,Degree值越大,节点面积越大,表示该节点的生物功能越重要。

图4 药物-活性成分-靶点网络图

2.5 关键靶点基因的GO与KEGG富集分析

2.5.1 关键靶点基因的GO富集分析 对核心靶点进行GO分析,运用R软件分析后获得生物过程(biological process,BP)2 043个、细胞组分(cellular component,CC)29个、分子功能(molecular function,MF)74个。排名前10位靶点基因的GO富集分析结果详见图5。

图5 养心氏片和心肌纤维化“交集靶点”的GO富集分析

2.5.2 关键靶点基因的KEGG富集分析 KEGG富集分析获得165条结果,将富集显著性最大的20条结果以气泡图输出。详见图6。

2.6 分子对接分析 利用AutoDock vina软件,选取PPI网络Degree值排名前8位的蛋白与养心氏片作用心肌纤维化Degree值排名前8位的活性成分进行分子对接,以最低结合效能表示分子与靶点的结合性,将结果以热图形式展示,见图7。靶点蛋白与药物成分之间的结合活性度越高,结合能则越小,表示对接性越好,以≤-5.0 kJ/mol表示分子与靶点结合性较好[7]。对接结合效能最小的4个模型的相互作用见图8。

图7 分子对接结合热图

图8 核心成分与靶点分子对接结合较好的4个结果图

3 讨 论

心肌纤维化在心血管疾病中普遍存在,心肌纤维化可引起心肌舒缩、传导功能及代谢异常,并在心室重构中发挥重要作用,造成心力衰竭、各种心律失常等心血管疾病的发生,心肌纤维化是导致心脏结构重构的重要因素之一,但其发病机制尚不清楚[8]。中医根据辨证选方进行个体化用药,具有副作用小、耐药性低、能有效缓解病人临床症状等优势[9]。因此,中医药在治疗心肌纤维化方面隐藏着巨大潜力。本研究通过网络药理学并结合系统生物学、计算机技术和医学信息等多学科知识进行探讨,正契合了中医学整体观和辨证论治的治疗原则。

3.1 养心氏片关键靶点分析 本研究通过网络药理学方法系统分析养心氏片治疗心肌纤维化的潜在作用机制,获得养心氏片活性成分269个,其作用于心肌纤维化的潜在靶点4 787个;通过疾病数据库获得心肌纤维化相关靶点5 537个,养心氏片治疗心肌纤维化潜在靶点224个。PPI网络分析显示,养心氏片治疗心肌纤维化的靶点主要有表皮生长因子受体(EGFR)、雌激素受体(ESR1)、白细胞介素-1B(IL-1B)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素-6(IL-6)、转录因子AP-1 (JUN)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤蛋白p53(TP53)、血管内皮生长因子(VEGFA)等;结合文献分析,其中AKT1信号传导可抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及改善压力过载引起的心脏重塑,参与心肌肥厚和重塑过程,进而改善心功能[10]。TNF是免疫中枢的调节因子,有促炎作用,研究表明肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)对组织重塑、肥大、炎症和细胞死亡产生相反的作用,TNFR1激活会加剧左心室重构,而TNFR2会改善左心室重构[11]。TP53是2个转录因子,在心肌损伤后TP53蛋白水平短暂降低,TP53表达或活性的潜在调节剂多存在于心肌损伤部位,包括大分子损伤、炎症和缺氧等,其在细胞分化状态的转变中发挥重要作用[12]。EGFR是一种跨膜糖蛋白,是表皮生长因子受体家族中的一员,属于受体酪氨酸激酶家族。EGFR作为细胞表面蛋白可与配体如表皮生长因子(EGF)结合,EGFR被激活后可再磷酸化下游蛋白,调节存活的信号通路[13]。综上所述,养心氏片关键靶点可通过改善炎症反应、调控细胞的凋亡、改善心室重塑、改善心功能等不同角度来抗心肌纤维化,达到治疗目的。

3.2 养心氏片活性成分分析 在“药物-活性成分-靶点”网络分析中,活性成分Degree值排名较前的活性成分为β-谷甾醇、异黄酮、芒柄花黄素、金英花碱、异鼠李素、山柰酚、槲皮素等,与疾病靶点关联密切,可能是养心氏片治疗心肌纤维化的核心活性成分。其中β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗抑郁等生物活性,其通过调节过氧化物酶体增殖物激活受体/核因子激活的B细胞的κ-轻链(PPARγ/NF-κB)增强信号来延缓心肌损伤,以减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡程度[14]。槲皮素作用于一氧化氮合成酶抑制剂直接对体内的一氧化氮发挥调节作用,可减轻心肌损伤[15]。异黄酮可降低心脏病的发病率,减少血清总胆固醇浓度,抑制氧自由基产生及脂质过氧化;还可通过介导一氧化氮合酶的激活促进一氧化氮生成并释放,起到保护血管内皮的作用;研究发现,血管内皮富含的雌激素受体(β-ER)是异黄酮首选的结合点[16-17]。异鼠李素对过氧化氢(H2O2)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的内皮细胞损伤具有保护作用,其以浓度依赖性方式抑制AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成,从而达到预防心肌纤维化的作用[18]。山柰酚则可抑制AngⅡ诱导的心室重构,下调心肌组织成纤维化程度[19]。以上均表明养心氏片有效成分可能通过抗炎、抗氧化、减少心肌内皮细胞损伤,从而达到抗心肌纤维化的作用。

3.3 活性成分与关键靶点作用分析 GO分析结果显示,在生物学过程中主要通过调节氧化应激、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、上皮细胞增殖、DNA-结合转录因子活性等来调控;在细胞组分方面则有膜筏、膜微区、膜区等核心基因富集;在分子功能上则有转录因子、配体激活等核心基因富集,表明养心氏片可能通过上述富集结果发挥作用。

KEGG富集结果表明,交集靶点主要富集在心肌纤维化晚期糖基化终末产物/晚期糖基化终末产物受体(AGE/RAGE)信号通路、低氧诱导因子(HIF-1)信号通路、TNF信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、松弛素信号通路、C型凝集素受体信号通路。这些通路可能是养心氏片抗心肌纤维化的主要通路。AGE/RAGE信号通路已被证明与增加的肌成纤维细胞形成和间质纤维化独立相关,可重塑激活的心肌细胞[20]。HIF-1是维持氧平衡的重要调节因子,通过调节血管生成和血管重塑来控制氧气的输送,还可在代偿肥大阶段刺激适应性血管生成发挥保护作用,但下调心脏微血管内皮细胞中HIF-1表达,可抑制内皮细胞间质转化,改善心肌纤维化[21-22]。TNF信号通路可逆转心血管结构和功能,其中,TNF-α是TNF信号通路的一种促炎细胞因子,TNF-α中的B细胞还参与抗心肌纤维化[23]。研究表明,IL-17及相关细胞因子可导致间质纤维化和微血管内皮功能障碍,其在促心肌纤维化和不可逆左心室重构中发挥重要作用,充分表明其是心肌纤维化的危险因素[24]。松弛素是胰岛素-松弛素超家族中的一种6 kDa肽,通过G蛋白偶联受体、松弛素家族肽受体1进而激活多个信号通路,达到抑制心律失常、抗炎、逆转心肌纤维化的作用[25]。除C型凝集素受体信号通路未查到相关报道外,其余文献报道与本研究结果一致,分子对接结果也佐证了主要活性成分与关键靶点均具有较强的结合活性。

综上所述,本研究采用网络药理学和分子对接技术,对养心氏片治疗心肌纤维化的活性成分、作用靶点和信号通路进行阐述,结果显示养心氏片抗心肌纤维化具有多靶点、多成分、多通路的作用,为临床应用提供依据,但是上述核心靶点和通路有待进一步的动物实验和细胞实验验证,为临床实践和基础研究提供更强有力的支持。