miR-499a-5p靶向调控CDKN1A基因在心肌细胞肥大中的作用机制研究

牟寒霜,黄 震,郭 婧

心肌肥大主要是心脏对各种应激的生理代偿性反应,表现为收缩蛋白表达增加和心肌细胞体积增大。尽管近年来在心肌肥大功能方面的研究取得了较大进展,但潜在的分子机制仍不明确[1]。越来越多的研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)在很大程度上与多种人类疾病的发生和发展有关,包括心肌肥大[2-3]。miRNA是一类非编码RNA,长度为20～25个核苷酸,其主要在转录后水平上发挥翻译抑制作用或使mRNA降解以调节基因表达并影响多种病理生理过程。有研究显示,miR-499a-5p在心肌缺血再灌注损伤和急性心肌梗死中发挥重要作用[4-5]。miR-499a-5p可能是介导心脏功能的关键调节剂[6]。然而,miR-499a-5p在心肌肥大中的作用尚不明确。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)属于Cip/Kip家族,在细胞周期进程中发挥重要作用。研究报道,CDKN1A的过度表达能够促进细胞逃避细胞周期阻滞、衰老和凋亡[7];且CDKN1A与病毒性心肌炎、心肌发育以及肥厚型心肌病相关[8]。本研究探讨miR-499a-5p在心肌肥大中的作用及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠心肌细胞H9c2(美国HyClone公司);DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);细胞计数试剂盒(CCK-8)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)(美国Sigma公司);CDKN1A、Cleaved Caspase-3、心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)单抗及二抗(美国CST公司);AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(大连宝生物工程有限公司);TRIzol试剂、逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒(赛默飞世尔);miR-499a-5p mimics和mimics control(上海吉玛制药)。细胞培养箱(美国Thermo公司);流式细胞仪(美国Becton Dickinson);荧光显微镜(日本Olympus公司)。双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京全式金生物)。

1.2 H9c2细胞培养 心肌细胞H9c2培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清)中,于5% CO2、37 ℃培养箱中培养,每隔1～2 d更换1次新的培养液。待H9c2细胞生长到80%以上时加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞,采用胰蛋白酶消化并传代培养。

1.3 H9c2细胞分组和处理 H9c2细胞以胰蛋白酶消化后接种到24孔板中,加入新的培养液,于37 ℃培养箱继续培养,24 h后更换含1%胎牛血清的培养液培养细胞同步化处理。将H9c2细胞随机分为正常对照(Con)组、细胞肥大模型(AngⅡ)组、转染对照(AngⅡ+miR-NC)组和转染(AngⅡ+miR-499a-5p)组。其中,AngⅡ组H9c2细胞经1 μmol/L的AngⅡ刺激48 h构建心肌细胞肥大模型[9];AngⅡ+miR-NC组和AngⅡ+miR-499a-5p组H9c2细胞分别经脂质体2000转染mimics control或miR-499a-5p mimics,具体操作参照使用说明书进行,转染后采用1 μmol/L的AngⅡ刺激48 h。Con组H9c2细胞未行任何处理。

1.4 H9c2细胞表面积的测定 采用荧光显微镜观察测定各组H9c2细胞的横截面,使用Image J软件分析细胞横截面积,计算心肌细胞表面积[9]。

1.5 qRT-PCR检测miR-499a-5p的表达水平 H9c2细胞经分组处理后,使用TRIzol试剂分别抽提各组H9c2细胞中总RNA,分析RNA的浓度和纯度,使用逆转录试剂盒将总RNA合成cDNA,调整cDNA的浓度,并以其为模板,使用qRT-PCR检测试剂盒进行qRT-PCR检测,反应程序:95 ℃ 5 min,随后循环40次,95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s。反应结束后分析曲线,以U6为内参,采用2-△△Ct法分析各组H9c2细胞中miR-499a-5p的相对表达水平。

1.6 CCK-8检测H9c2细胞活力 H9c2细胞以6×103个/孔种植到96孔板中,继续培养,按照上述1.3的方法分组处理,同时设置不加细胞的空白调零孔组,向每孔中添加CCK-8溶液,于37 ℃培养箱培养2 h,使用酶标仪测定波长在450 nm处吸光度(OD)值,计算细胞活力(%)=(实验组OD值-空白调零组OD值)/(对照组OD值-空白调零组OD值)×100%。

1.7 流式细胞术检测H9c2细胞凋亡率 H9c2细胞以1×106个/孔种植到6孔板中,按照上述1.3的方法分组处理后,除去细胞培养液,以PBS洗涤,收集各组H9c2细胞,使用AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒添加检测试剂,使用流式细胞仪测定各组H9c2细胞凋亡率。

1.8 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达水平 分别收集处理后各组H9c2细胞,加入适量裂解液,于冰上裂解后提取蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法对蛋白进行定量测定。蛋白与上样缓冲液混匀并于沸水至加热使蛋白变性,将等量蛋白上样行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),随后电转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,将膜置于5%脱脂奶粉中封阻2 h,洗膜后加入1∶800稀释的一抗,于4 ℃过夜,次日再加入1∶3 000稀释的二抗,在室温下孵育2 h,采用增强化学发光法(ECL)进行显影,使用凝胶成像系统采集图像,以GAPDH作内参,使用Image J软件分析灰度值,分别计算H9c2细胞中CDKN1A、Cleaved Caspase-3、ANP、BNP和β-MHC蛋白相对表达水平。

1.9 靶基因预测和荧光素酶报告基因检测 使用TargetScan预测和分析miR-499a-5p与CDKN1A的结合位点。将含有与miR-499a-5p互补的结合位点的野生型(WT)CDKN1A序列和突变型(MUT)CDKN1A序列构建至pmirGLO载体上,形成CDKN1A的野生型和突变型报告载体。将H9c2细胞(4×105个/孔)接种至6孔板上,使用Lipofectamine 2000转染试剂将CDKN1A-WT和CDKN1A-MUT分别与mimics control或miR-499a-5p mimics共转染至细胞,并分为mimics control和CDKN1A-WT共转染组、miR-499a-5p mimics和CDKN1A-WT共转染组、mimics control和CDKN1A-MUT共转染组、miR-499a-5p mimics和CDKN1A-MUT共转染组,48 h后检测相对荧光素酶活性。

2 结 果

2.1 各组H9c2细胞中miR-499a-5p和CDKN1A蛋白表达水平比较 与Con 组比较,AngⅡ组H9c2细胞中miR-499a-5p的表达水平明显降低,而CDKN1A蛋白的表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组和AngⅡ+miR-NC组比较,AngⅡ+miR-499a-5p组H9c2细胞中miR-499a-5p的表达水平明显升高,而CDKN1A蛋白的表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);AngⅡ组和AngⅡ+miR-NC组比较,miR-499a-5p和CDKN1A蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1、表1。

图1 H9c2细胞中CDKN1A蛋白表达条带图

表1 各组H9c2细胞中miR-499a-5p和CDKN1A蛋白表达水平比较(±s)

2.2 各组H9c2细胞肥大相关指标比较 与Con组比较,AngⅡ组细胞表面积及ANP、BNP和β-MHC蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组和AngⅡ+miR-NC组比较,AngⅡ+miR-499a-5p组细胞表面积及ANP、BNP、β-MHC蛋白表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);AngⅡ组和AngⅡ+miR-NC组比较,细胞表面积及ANP、BNP、β-MHC表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图2、表2。

图2 各组H9c2细胞中ANP、BNP和β-MHC蛋白表达条带图

表2 各组细胞表面积及ANP、BNP、β-MHC蛋白表达水平比较(±s)

2.3 各组H9c2细胞活力比较 与Con 组比较,AngⅡ组H9c2细胞活力明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组和AngⅡ+miR-NC组比较,AngⅡ+miR-499a-5p组H9c2细胞活力明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);AngⅡ组和AngⅡ+miR-NC组H9c2细胞活力比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组H9c2细胞活力比较(±s) 单位:%

2.4 各组H9c2细胞凋亡情况比较 与Con 组比较,AngⅡ组H9c2细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组和AngⅡ+miR-NC组比较,AngⅡ+miR-499a-5p组H9c2细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);AngⅡ组和AngⅡ+miR-NC组比较,H9c2细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图3、图4、表4。

图3 各组H9c2细胞凋亡流式图

图4 各组H9c2细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达条带图

表4 各组H9c2细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较(±s)

2.5 miR-499a-5p靶基因检测 生物信息学软件TargetScan预测结果显示,miR-499a-5p和CDKN1A存在特异性结合位点,提示CDKN1A可能是miR-499a-5p的一个靶基因。通过双荧光素酶报告基因实验进行验证,结果显示,与mimics control+CDKN1A-WT组比较,miR-499a-5p mimics+CDKN1A-WT组H9c2细胞的相对荧光素酶活性降低了约78%,差异有统计学意义(P<0.05),而与mimics control+CDKN1A-MUT组比较,miR-499a-5p mimics+CDKN1A-MUT组H9c2细胞的相对荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。详见图5、表5。

图5 TargetScan软件预测miR-499a-5p和CDKN1A结合位点示意图

表5 各组H9c2细胞的相对荧光素酶活性比较(±s)

3 讨 论

虽然成年哺乳动物心肌细胞已分化并停止增殖,但心肌组织仍具有可塑性,并可能发生重构(如肥大)。肥大过程是心肌细胞对肥大刺激的适应性反应,使心脏维持正常功能。生理性心肌肥大是可逆的,心脏表现为正常的形态即心肌细胞无纤维化或细胞凋亡。然而,持续的肥大刺激通常会导致不可逆的心肌肥大和心功能不全,被认为是病理性心肌肥大。病理性心肌肥大发生在疾病(如高血压、局部缺血和心肌炎等)的环境中,并与间质纤维化、细胞死亡和心脏功能障碍增加有关[10]。病理性心肌肥大是心力衰竭的关键危险因素[11]。研究表明,miRNA在心血管疾病(包括心肌肥大)中具有重要的调节作用。例如,miR-26a-5p在体外抑制糖原合酶激酶3β(3GSK3β)表达,促进心肌肥大[12]。miRNA-26b通过靶向CDK6进而抑制心肌细胞肥大[13]。虽然miRNA参与了心肌肥大的发生,但大多数miRNA参与心肌肥大的机制仍需进一步研究。miR-499a-5p可以抑制癌症的进展,例如miR-499a-5p通过靶向VAV鸟嘌呤核苷酸交换因子3(VAV3)抑制子宫内膜癌的生长和转移[14];miR-499a-5p通过靶向真核细胞翻译起始因子(eIF4E)抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮-间充质转化,增强宫颈癌细胞的放射敏感性[15]。此外,已经有研究发现,miR-499a-5p通过靶向调节沉默信息调节因子1(SIRT1)加重脂多糖诱导的急性肺损伤[16]。miR-499a-5p还与心血管疾病相关,例如miR-499a-5p可通过下调Caspase-3并上调Bcl-2蛋白表达来抑制心肌细胞的凋亡[17]。一项研究表明,心肌梗死时释放的miR-499通过靶向α7烟碱乙酰胆碱受体(α7-nAchR)引起内皮损伤[18]。另一项研究显示,miR-499通过SRY盒转录因子6(Sox6)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)调节晚期心脏分化过程中的细胞增殖和凋亡[19]。本研究结果显示,miR-499a-5p通过靶向Kirsten鼠肉瘤基因CDKN1A对心肌细胞肥大发挥保护作用。

本研究发现,AngⅡ诱导的H9c2细胞表面积明显增大,细胞肥大标志蛋白ANP、BNP和β-MHC的表达明显升高,细胞活力明显降低,细胞凋亡率明显升高,且与凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达亦明显上调,表明AngⅡ诱导的H9c2细胞能够促进心肌细胞肥大。而过表达miR-499a-5p能够减少细胞表面积的增加,降低ANP、BNP和β-MHC蛋白的表达,细胞活力升高,凋亡减少,这表明过表达miR-499a-5p能够有效抑制心肌细胞肥大。此外,本研究发现,CDKN1A是miR-499a-5p的直接靶基因。本研究使用在线工具TargetScan预测miR-29b-3p的潜在靶基因之一CDKN1A的结合位点,并验证了二者之间的相互作用。CDKN1A在人类多种癌症中异常表达,且有研究显示其介导心血管疾病[20-22]。肿瘤相关成纤维细胞源性外体microRNA-98-5p通过靶向CDKN1A促进卵巢癌顺铂耐药[23]。有研究数据表明,CDKN1A在晚期KRAS突变的非小细胞肺癌中对顺铂-培美曲塞联合治疗的反应中起作用,因此其可作为一项预测标志物[21]。全基因组关联和孟德尔随机分析发现,CDKN1A参与心力衰竭的发病机制[24]。本研究发现,在AngⅡ刺激下H9c2细胞中miR-499a-5p对CDKN1A的表达有负调控作用,提示miR-499a-5p通过调节CDKN1A参与心肌肥大。

综上所述,本研究结果显示,miR-499a-5p在AngⅡ诱导的H9c2细胞中明显下调,而CDKN1A的表达明显上调。过表达miR-499a-5p能够抑制AngⅡ诱导的H9c2细胞肥大,其作用机制与靶向抑制CDKN1A的表达有关。本研究揭示了miR-499a-5p与心肌肥大的关系,提示miR-499a-5p可能是治疗心肌肥大的潜在有效靶点。