基于网络药理学和临床观察探讨参芪健心方干预气虚血瘀型慢性心力衰竭的临床疗效和机制

郭言午,方才敬,施俊峰,刘 攀,戴小华

慢性心力衰竭(CHF)是由各种心脏疾病引起的心室舒缩功能障碍的一种临床综合征,具有发病率高及病死率高的特点,且CHF病人病程较长,机体耐受力、免疫力差,临床常采用强心剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、β受体阻断剂、醛固酮受体拮抗剂等进行常规治疗,尽管治疗方案不断优化,但远期疗效始终欠佳,病人再住院率高、生活质量低的问题仍未能很好解决[1-3]。

参芪健心方的组方成分为黄芪、红参、茯苓、白术、淫羊藿、丹参、桂枝、葶苈子。既往药理学研究表明,参芪健心方具有抑制心室重构、抗动脉粥样硬化、减轻心脏循环系统病理性改变、改善心功能等功效[4]。网络药理学具有整体性及系统性的特点,可在分子层面探究中医药治疗疾病的多成分、多靶点、多途径[5-6]。本研究通过网络药理学方法筛选参芪健心方干预气虚血瘀型慢性心力衰竭的核心靶点及有效成分,并探讨其有效成分、靶点、信号通路等之间的联系,为研究其多靶点治疗慢性心力衰竭的作用机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月—2019年12月就诊于安徽中医药大学第一附属医院心内科西医确诊为慢性心力衰竭,且中医辨证为气虚血瘀证的病人60例,随机分为对照组和治疗组,每组30例,其中治疗组1例病人因服药依从性差脱落,最终完成29例。两组病人一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 诊断标准 西医诊断参考《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》[7]中慢性心力衰竭的诊断标准;中医诊断及证型参考2014年《慢性心力衰竭中医诊疗专家共识》[8]、《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》[9],符合慢性心力衰竭气虚血瘀型的证候标准。

1.3 纳入标准 同时符合上述中、西医诊断标准;年龄18～90岁,性别不限;自愿参加并签署知情同意书;符合HFrEF、HFmrEF诊断标准;中医证型属于气虚血瘀证;NYHA心功能分级Ⅱ级或Ⅲ级;原发病为冠心病、高血压、扩张型心肌病、心脏瓣膜病。

1.4 排除标准 射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)、急性心力衰竭、经手术或器械治疗者;严重肝、肾功能异常;精神病病人;对试验药物过敏者;急性冠脉综合征(30 d内)、心源性休克;妊娠及哺乳期妇女;近3个月内参加其他临床研究者;合并严重疾病如恶性肿瘤、恶性心律失常、肥厚梗阻型心肌病、高度房室传导阻滞未置入起搏器、重度贫血、甲状腺功能亢进危象等严重内分泌疾病、消化道出血等重症消化疾病者。

1.5 剔除、脱落标准 病人依从性差,不能配合治疗者;入组期间出现药物过敏者;自行要求退出者;发生严重不良事件、并发症者。

1.6 干预方法 两组均连续治疗4周。

1.6.1 对照组 ①ACEI:盐酸贝那普利片(10～20 mg,每日1次,北京诺华制药有限公司生产,规格:每片10 mg,批号:H20030514),如病人不能耐受盐酸贝那普利的副作用及不良反应,可酌情调整为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)缬沙坦胶囊(80～160 mg,每日1次,北京诺华制药有限公司生产,规格:每片80 mg,批号:H20040217);②β受体拮抗剂:琥珀酸美托洛尔缓释片(23.75～47.50 mg,每日1次,阿斯利康制药有限公司生产,规格:每片47.50 mg,批号:J20150044);③醛固酮受体拮抗剂:螺内酯片(20 mg,每日1次,江苏正大丰海制药有限公司生产,规格:每片20 mg,批号:H32020077)。

1.6.2 治疗组 在对照组基础上加用参芪健心方,水煎服,每日1剂,早晚分服。

1.7 观察指标

1.7.1 中医证候积分 两组病人于治疗前后参照《中药新药临床研究指导原则》[10],采用中医证候积分表进行评分。

1.7.2 NYHA心功能分级 参照NYHA分级标准中的心功能疗效评定标准,显效:心功能改善≥2级;有效:心功能改善1级;无效:心功能改善不足1级;恶化:心功能恶化≥1级[11]。

1.7.3 血清BNP水平 分别于治疗前后采集病人上肢肘静脉血4 mL,采用免疫荧光检测法检测BNP水平,检测仪器为美国雅培公司AXSYM仪,由安徽中医药大学第一附属医院临床生化检验室规范操作完成。

1.7.4 心脏超声 采用GE公司VIVID7型号超声检测仪检测LVEF、LVEDD值。

1.7.5 6MWD 测量病人6 min内直线行走的最大距离,若试验过程中病人出现头晕、胸闷、胸痛、憋喘、冷汗出、面色苍白等不能耐受情况时,应立即终止试验。依据《老年患者6分钟步行试验临床应用中国专家共识》[12]:6MWD<150 m为重度心力衰竭;150～450 m为中度心力衰竭;>450 m为轻度心力衰竭。

1.8 网络药理学分析 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP),以口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为限制条件搜索参芪健心方各中药成分及其作用靶点;使用Cytoscape 3.8.1制作中药成分-靶点图,可视化中药成分-靶点之间的具体联系;以评分(Score)≥5.0分为限制条件,使用GeneCards数据库搜索慢性心力衰竭相关靶点;将中药靶点、疾病靶点取交集,获得交集基因(DEGs);以置信度≥0.4为限制条件,使用STRING数据库对交集基因进行分析,获得蛋白质-蛋白质互作图(PPI),并保存为制表符分隔值(TSV)格式,使用Cytoscape 3.8.1对PPI进行可视化处理;使用DAVID数据库对DEGs进行基因名(gene symbol)转化,转换为集合基因(ENSG)格式,使用基迪奥生物信息云(Omic Share)平台对DEGs进行基因本体(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。

2 结 果

2.1 两组中医证候积分比较 治疗后,两组中医证候积分较治疗前下降,且治疗组下降更明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组中医证候积分比较(±s) 单位:分

2.2 两组NYHA心功能分级疗效比较 治疗后,治疗组NYHA心功能分级疗效总有效率大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组NYHA心功能分级疗效比较

2.3 两组血清BNP水平比较 治疗后,两组血清BNP水平较治疗前下降,且治疗组血清BNP水平下降更明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 两组血清BNP水平比较(±s) 单位:pg/mL

2.4 两组6MWD比较 治疗后,两组6MWD均增加,且治疗组增加更明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表5。

表5 两组6MWD比较(±s) 单位:m

2.5 两组LVEF、LVEDD比较 治疗后,两组LVEF均较治疗前升高,且治疗组升高更明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组LVEDD与治疗前比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表6。

表6 两组LVEF、LVEDD比较(±s)

2.6 “成分-靶点”网络构建及关键化合物筛选 将基因数据导入Cytoscape 3.8.1软件,获得“成分-靶点”网络图,根据关联程度(Dgree)值筛选出参芪健心方各中药主要活性成分124个[槲皮素(quercetin)、7-0-甲基异鼠李糖醇(7-0-methylisothamitol)等],关键靶点1 419个。详见图1。

图1 参芪健心方“成分-靶点”网络图

2.7 构建PPI网络图 通过TCMSP,以OB≥30%、DL≥0.18为限制条件搜索参芪健心方各中药成分及其作用靶点;使用Cytoscape 3.8.1制作中药成分-靶点图,可视化中药成分-靶点之间的联系;以评分(Score)≥5.0分为限制条件,使用GeneCards数据库搜索慢性心力衰竭相关靶点,获得慢性心力衰竭靶点241个;将中药靶点、疾病靶点取交集,获得白介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素1β(IL1β)、血管内皮生长因子(VEGFA)等22个DEGs,设置置信度≥0.4,排除游离基因后获得PPI网络图。详见图2、图3。

图2 参芪健心方-慢性心力衰竭交集基因PPI图

图3 交集基因可视化PPI图

2.8 GO和KEGG分析 对22个交集基因进行GO分析后发现,细胞组分(CC)主要富集于细胞质膜、细胞外围等处(见图4);分子功能(MF)主要富集于类蛋白结合、酶结合等方面(见图5);生物过程(BP)主要富集于多细胞生物过程调节、对有机物的反应等方面(见图6)。KEGG分析获得与交集DEGs相关的前20个信号通路(见图7)。

图4 细胞组分分析

图5 分子功能分析

图6 生物过程分析

图7 KEGG富集分析

3 讨 论

西医认为慢性心力衰竭是多种因素共同作用引起的心肌受损[13],已成为重点关注的公共卫生问题[14]。目前,针对心力衰竭的治疗着重于防止和延缓心肌重构[15],从而降低其死亡率和再住院率等。中医将本病归属于“心衰”“喘证”“水肿”等范畴,形成的根本原因是心脏脏器、脏真受损,心脏气血阴阳衰竭,危及五脏六腑及全身气血阴阳气化升降出入。而五脏六腑的气化失常,又进一步导致内生邪实(如瘀血痰浊、水气痰饮、寒湿凝滞等)的产生,从而形成虚更虚、实更实的恶性循环,为“本虚标实,标本具病”之证。因此,本病病因可归纳为痰、瘀、虚,而痰责之于脾,瘀责之于心肺,虚则是正气不足,可见本病与肺、脾、心、肾关系最为密切;主要病机为心气、心阳不振。故临床治疗本病时可采用益气活血法。戴小华教授基于中医基础理论及多年临床经验创参芪健心方,方中含黄芪、红参、茯苓、白术、淫羊藿、丹参、桂枝、葶苈子等药材,其中黄芪、红参益气温阳为君药,茯苓、白术、淫羊藿为臣药以益脾肾之气,丹参、桂枝温经通络,葶苈子泻肺平喘,三者为佐使药,共同发挥补气温阳、化瘀利水功效,使气旺、阳足、瘀消、水行。

本研究结果表明,治疗后,两组病人中医证候积分较治疗前下降,且治疗组下降更明显(P<0.05),表明参芪健心方可改善病人临床症状、降低中医证候积分;治疗后,治疗组病人BNP水平较对照组明显降低(P<0.05),表明参芪健心方可降低BNP水平,改善心功能;治疗后,治疗组病人6MWD明显高于对照组(P<0.05),表明参芪健心方可改善病人运动耐量。网络药理学研究发现,参芪健心方和慢性心力衰竭的交集基因有22个,其中关键交集基因为IL6、TNF、IL1β、VEGFA。核心差异基因主要在细胞质膜、细胞外围等处富集,与类蛋白结合、酶结合相关,参与多细胞生物过程调节、对有机物的反应等过程。参芪健心方防治慢性心力衰竭的主要活性成分为槲皮素、7-0-甲基异鼠李糖醇等,机制可能是通过干预动脉粥样硬化、晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE/RAGE)、白介素17(IL17)信号通路防治慢性心力衰竭。

参芪健心方由红参、黄芪、茯苓、白术、桂枝、丹参、淫羊藿、葶苈子组成,现代药理学研究表明,红参中的人参皂苷可保护血管内皮、抗动脉粥样硬化、抑制心肌细胞增大、逆转心室重构及调节心肌能量代谢[16]。黄芪最主要的药用成分为黄芪甲苷和黄酮类化合物芒柄花素,黄芪甲苷有助于减轻心脏循环系统病理性改变,维持脑循环,控制血压;芒柄花素能够拮抗活性氧和超氧离子通道,保护心肌细胞[17-18]。茯苓的特征性成分是三萜类,可通过阻断肾小管远曲小管Na+与K+、H+之间的交换,达到利尿的作用[19]。白术的主要成分是白术内酯、多糖等,具有抗炎、利尿、抗血小板聚集、降糖、呼吸兴奋、抗肿瘤、调节胃肠道功能、调节子宫平滑肌等药理作用[20]。桂枝可通过阻断转化生长因子β1(TGF-β1)信号通路,发挥抗心肌纤维化的作用[21]。丹参中的丹参素具有保护心肌、缓解心肌缺血再灌注损伤的作用[22]。丹参酮ⅡA可减轻氧化应激,同时能够加强氧自由基的消除,抗心肌纤维化[23]。淫羊藿主要成分为淫羊藿苷、总黄酮、淫羊藿多糖等,具有抗细胞钙化、抗氧化、抗衰老、调节免疫作用,可通过调节能量生成通道促进能量生成而防治心力衰竭[24-25]。葶苈子的主要成分有强心苷、硫苷和异硫氰酸、香豆素等,实验研究发现,葶苈子具有利尿作用,其抗心力衰竭机制主要是缓解氧化应激,抑制神经体液机制激活,逆转心室重构[26-28]。

综上所述,本研究在临床观察结果有效的基础上通过网络药理学工具探析参芪健心方干预气虚血瘀型慢性心力衰竭的可能机制,为后续设计实验证明其具体作用机制奠定基础,也为临床防治本病提供参考。